第三节 特殊杂质的检查方法
药物中的特殊杂质系指在药物的生产和贮藏过程中，因生产工艺或药物本身性质可能引入的杂质。特殊杂质种类很多，检查方法各异，主要是利用药物和杂质在物理和化学性质上的差异选择适当的方法进行检查。常用的特殊杂质检查方法一般有物理法、化学法、光谱法和色谱法。
一、 物理法
物理法是利用药物与特殊杂质在臭味、挥发性、溶解性、旋光性及颜色等方面的物理性质差异，对杂质直接进行检查。
1. 臭味及挥发性的差异
药物中存在的杂质，如具有特殊臭味，而药物本身无这种特殊臭味，那么利用这种差异即可判断某些药物中是否有特殊杂质存在。
例如，乙酸具有刺激性特臭，但在制备过程中可能引入其他具有异臭的杂质，故药典规定乙酸的“异臭”检查为：取乙酸5ml，加氢氧化钠试液中和后，煮沸，除有乙酸臭气外，不得发生其他臭气。又如，樟脑在常温中易挥发，但其从樟科植物中提取时，可能引入不挥发性杂质，故药典对樟脑（天然）要求需进行“不挥发物”检查，方法是取樟脑2g，在100℃加热，使樟脑全部挥发，并干燥至恒重，遗留的不挥发物残渣不得超过0.05%，借以控制杂质的量。
2. 溶解度的差异
利用有些药物可溶于水、有机溶剂或酸、碱液中，而杂质不溶；或者某些杂质可溶于水、有机溶剂或酸、碱液中，而药物本身不溶的差异检查药物中的特殊杂质。例如，葡萄糖在生产过程中容易混入糊精，而葡萄糖可溶于乙醇，糊精难溶于乙醇，故药典规定葡萄糖的“乙醇溶液的澄清度”的检查为：取本品1g，加乙醇20ml，置水浴上加热回流40min，溶液应澄清，若有糊精混入，则乙醇液混浊，借以检查糊精（杂质）的存在。
3. 旋光性的差异
比旋度（或旋光度）的数值可以用来反映药物的纯度，利用旋光性质的差异，可以控制杂质的限量。如《中国药典》规定盐酸土霉素加盐酸液（9→1000），配置成每1ml中含10mg的溶液，避光放置1h，测定比旋度为-188°～-200°，如测得值不在此范围，则表明杂质超过限量，其纯度不符合要求。
若药物本身没有旋光性，而杂质有，则可通过限定溶液的旋光值来控制相应杂质的限量。例如，《中国药典》对硫酸阿托品中莨菪碱的检查规定：测定供试品溶液（50mg/ml）的旋光度，不得超过-0.40°，以控制莨菪碱的限量（2.46%）。
4. 颜色的差异
某些药物自身无色，但从生产中引入了有色的有关物质，或在贮藏过程中分解而产生有色杂质。采用检查溶液颜色的方法，可以控制药物中有色杂质的量。如对乙酰氨基酚中乙醇溶液颜色检查规定：取本品1.0g，加乙醇10ml溶解后，溶液应无色；如显色，与棕红色2号或橙红色2号标准比色液比较，不得更深。以此控制生产时可能引入的中间体对氨基酚的有色氧化物。
二、 化学法
1. 酸性或碱性的差异
利用药物与杂质之间酸碱性质的差异进行检查。例如，苯巴比妥在合成时可能引入杂质苯基丙二酰脲及其他酸性杂质，药典利用它们的酸性强于苯巴比妥，故将苯巴比妥供试品加水煮沸，放冷，滤过，弃去滤渣，取滤液加甲基橙指示液不得显红色，借此检查苯巴比妥中是否有苯基丙二酰脲及其他酸性物质存在。
2. 杂质与一定的试剂产生沉淀或颜色
利用药物中存在杂质与一定的试剂产生沉淀或颜色来检查药物中存在的杂质。如《中国药典》控制硫酸钡（Ⅰ型）中酸溶性钡盐，检查方法为：取酸中溶解物项下遗留的残渣，加水10ml搅拌后，用经盐酸溶液（1→40）洗过的滤纸滤过，滤液加稀硫酸0.5ml，静置30min，不得发生混浊。
3. 杂质与一定的试剂产生气体
利用杂质与一定试剂反应产生气体，来控制杂质限量。某些药物中的氨化合物或铵盐在碱性条件下加热，如有铵盐存在，则可分解放出氨，它遇碱性碘化汞钾试液显色，而药物本身不显色；又如，药物中若有微量硫化物存在，利用其在酸性条件下生成硫化氢气体放出，遇湿的醋酸铅试纸生成棕黑色的硫斑来检查杂质。《中国药典》控制氧化锌中碳酸盐，规定取供试品2.0g，加水10ml，混合后，加稀硫酸30ml，置水浴上加热，不得发生气泡。
4. 氧化还原性质的差异
利用药物与杂质在氧化还原性质上的差异进行检查。例如，氯化钠中常有溴化物或碘化物等杂质存在。检查碘化物时，可在氯化钠供试品中加入新配制的淀粉混合液（内含亚硝酸钠试液及硫酸液）湿润，在日光下放置，观察，5min内晶粒不得显蓝色痕迹。如有碘化物存在，则被亚硝酸钠氧化而析出碘，遇淀粉显蓝色，借此检查氯化钠中是否有碘化物的存在。
三、 光谱法
1. 紫外分光光度法
利用杂质在紫外光区有吸收，而药物在该波长处无吸收的性质差异进行检查。
例如，维生素C为白色结晶性粉末，贮藏久后易氧化变成淡黄色，药典规定维生素C 3.0g，加水15ml溶解后，溶液应澄清无色，滤过后，若有淡黄色，应在420nm波长处测定吸光度，不得超过0.03。又如肾上腺素在310nm波长处无吸收，而其杂质肾上腺酮在310nm波长处有最大吸收，故药典规定：取本品配成浓度为2mg/ml的盐酸溶液（0.5mol/L），在310nm波长处测定吸光度，不得超过0.05，借以控制肾上腺素中杂质肾上腺酮的限量，见图5-3。
2. 红外分光光度法
红外分光光度法主要用于药物中无效晶型或低效晶型的检查。某些多晶型药物由于晶型结构不同，可导致红外吸收光谱中某些特征峰的频率、峰形和强度出现差异。例如，甲苯咪唑中A晶型的检查。甲苯咪唑有三种晶型，其中C晶型为有效晶型，A晶型为无效晶型。无效A晶型在640cm-1处有强吸收，C晶型在此波数处的吸收很弱；而C晶型在662cm-1处有强吸收，A晶型在此处的吸收很弱。测定供试品在640cm-1和662cm-1处的吸光度之比，不得大于含A晶型为10%的甲苯咪唑对照品在上述两波长处的吸光度之比。甲苯咪唑的红外吸收图谱见图5-4。
图5-3 肾上腺素（点划线）和肾上腺酮（实线）的紫外吸收图谱
图5-4 甲苯咪唑的红外吸收图谱
3. 原子吸收分光光度法
原子吸收分光光度法主要用于药物中金属杂质的检查。该法灵敏度高，专属性强。一般操作方法为：取供试品，按规定配制成供试品溶液；另取等量供试品，加入限度量的待检元素，按相同方法制备，得对照溶液。先将对照溶液喷入火焰，调节仪器使具合适的读数a；在相同的条件下喷入供试品溶液，读数为b；b值小于a-b时，供试品中所含杂质元素符合规定；当b值大于a-b时，供试品中所含杂质元素超过限量，不符合规定。如维生素C中铜的检查。
四、 色谱法
药物中的一些杂质和药物结构接近，如中间体、副产物、分解产物等，必须分离后再检查。利用药物与杂质色谱行为的差异，可有效地将杂质与药物进行分离和检测，因而广泛应用于药物的杂质检查。色谱法是检查有关物质的首选方法。
1. 薄层色谱法
由于薄层色谱法灵敏、简便、快速，不需要特殊设备，因此在杂质检查中被广泛应用，常用的检查方法有以下四种。
（1）杂质对照品法 根据杂质限量，取一定浓度已知的杂质对照品溶液和供试品溶液，分别点在同一硅胶（或其他吸附剂）薄层板上，展开和定位后检查，供试品中所含该杂质的斑点，不得超过相应的杂质对照斑点。本法较为理想，适用于已知杂质并能制备杂质对照品的情况。
如呋喃唑酮中5-硝基糠醛二乙酸酯的检查（避光操作）：取本品约50mg， 精密称定， 置10ml量瓶中，加二甲基甲酰胺5ml，置水浴中微温使溶解，放冷，用丙酮稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取5-硝基糠醛二乙酸酯对照品适量，加二甲基甲酰胺-丙酮（1∶1）溶液溶解，并定量稀释制成每1ml中含5μg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各20μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-二氧六环（95∶5）为展开剂，展开，晾干，在105℃干燥5min，喷以盐酸苯肼溶液（取盐酸苯肼0.75g，加乙醇10ml使溶解，用水稀释至50ml，用活性炭脱色，滤过，取全部滤液，加盐酸25ml，加水至200ml），在105℃加热5min，供试品溶液如显与对照品溶液主斑点相应的杂质斑点，其颜色与对照品溶液主斑点比较，不得更深（1.0%）。
（2）供试品溶液自身稀释对照法 将供试品溶液按限量要求稀释至一定浓度作为对照溶液，与供试品溶液分别点于同一薄层板上，展开后定位、检查，供试品液所显杂质斑点不得深于对照溶液所显主斑点颜色。本法虽不及杂质对照品法理想，但其优点是不需要制备杂质的对照品，简便易行，所以应用较多。适用于杂质结构不能确定，或无杂质对照品的情况。采用本法时应注意供试品与所检杂质对显色剂所显的颜色应相同，显色灵敏度也应相同或相近。
例如，尼尔雌醇中有关物质的检查：取本品，加三氯甲烷-甲醇（9∶1）溶解并稀释制成每1ml中约含10mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置50ml量瓶中，用三氯甲烷-甲醇（9∶1）稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-丙酮（4∶1）为展开剂，展开，晾干，喷以硫酸-乙醇（4∶1），在105℃加热20min，置紫外光灯（365nm）下检视供试品溶液，如显杂质斑点，其颜色与对照溶液的主斑点比较，不得更深。
（3）杂质对照品法与供试品溶液自身稀释对照法并用 当药物中存在多个杂质时，其中已知杂质有对照品时，可采用杂质对照品法检查；未知杂质或没有对照品的杂质，则可同时采用供试品溶液自身稀释对照法检查。
例如，盐酸黄酮哌酯中有关物质的检查：取本品，加三氯甲烷-甲醇（1∶1）溶解并稀释制成每1ml中含20mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加上述溶剂定量稀释制成每1ml中含0.10mg的溶液，作为对照溶液；另取3-甲基黄酮-8-羧酸对照品，精密称定，加上述溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中含0.10mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各10μl ，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇-二乙胺（8∶2∶2∶1）为展开剂，展开，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视。供试品溶液如显杂质斑点，不得多于2个，其中在与对照品溶液相同位置上所显杂质斑点的颜色与对照品溶液的主斑点比较，不得更深，另一杂质斑点颜色与对照溶液的主斑点比较，不得更深。
（4）对照药物法 当无适合的杂质对照品，或供试品中杂质斑点颜色与主成分斑点的颜色有差异，难以判断其限量时，可选用与供试品相同的药物作为对照品，此对照药物中所含待检杂质应符合限量要求，且稳定性好。
例如，氢溴酸山莨菪碱中其他生物碱的检查：取本品与氢溴酸山莨菪碱对照品，分别加甲醇制成每1ml中含10mg的溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一氧化铝（中性，活度Ⅱ～Ⅲ级）薄层板上，用三氯甲烷-无水乙醇（95∶5）为展开剂，展开，晾干，喷以稀碘化铋钾试液-碘化钾碘试液（1∶1）。供试品溶液除显一个与对照品溶液主斑点位置相同的灰黑色斑点外，不得显其他斑点。
2. 高效液相色谱法
高效液相色谱法分离效能高，应用范围广，不仅可以分离，而且可以准确地测定各组分的峰面积和峰高，在杂质检查中应用日益增多。
（1）不加校正因子的主成分自身对照法 检查方法为将供试品溶液稀释成与杂质限度相当浓度的溶液，作为对照溶液，调节检测灵敏度（以噪声水平可接受为限）或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色谱峰的峰高达满量程的10%～25%或其峰面积能准确积分。取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，除另有规定外，供试品溶液的记录时间应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。
例如，维生素K1注射液中有关物质的检查（避光操作）：精密量取本品2ml，置20ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以无水乙醇-水（90∶10）为流动相；检测波长为270nm。精密量取对照溶液10μl 注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10%。再精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，扣除相对保留时间小于0.3的辅料峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积（1.0%） ，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2倍（2.0%）。
该法适用于没有杂质对照品、杂质与主成分的响应因子基本相同的情况。若杂质与主成分的响应因子超过0.9～1.1时，宜用加校正因子的主成分自身对照法或对照品对照法计算含量。
（2）加校正因子的主成分自身对照法 检查方法为按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节检测灵敏度（以噪声水平可接受为限）或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色谱峰的峰高达满量程的10%～25%或其峰面积能准确积分。然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样。供试品溶液的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。
该法适用于已知杂质的检查。该法的优点是不需杂质对照品，而又考虑到了杂质与主成分响应因子的不同所引起的测定误差，准确度较好。
（3）外标法测定供试品杂质的含量 该法适用于有杂质对照品或杂质对照品易得，而且进样量能够准确控制的情况。检查方法为：按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测定对照品和供试品中杂质的峰面积，按外标法计算杂质的含量。
例如，盐酸伐昔洛韦中有关物质的检查：本品适量，精密称定，加0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH值至3.0）溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置200ml量瓶中，用上述0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（pH3.0） 稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另取阿昔洛韦对照品约15mg，精密称定，置50ml量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠溶液2ml溶解，再用水稀释至刻度，摇匀，作为阿昔洛韦对照品贮备液，精密量取5ml，置200ml量瓶中，用上述0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（pH3.0）稀释至刻度，摇匀，作为阿昔洛韦对照品溶液。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH值至3.0）-甲醇（85∶15）为流动相；检测波长为251nm，柱温35℃。取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使伐昔洛韦峰的峰高约为满量程的25%。再分别精密量取对照溶液、阿昔洛韦对照品溶液与供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至伐昔洛韦峰保留时间的6倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，含阿昔洛韦的量按外标法以峰面积计算不得大于1.5%；其他各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积（0.5%）。
（4）内标法加校正因子测定杂质的含量 该法适用于有杂质对照品时的杂质检查。检查方法：精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器， 记录色谱图。测定对照品和供试品中杂质和内标物的峰面积，按内标法计算杂质的含量。
（5）峰面积归一化法，用于粗略考察供试品中的杂质 按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。本法通常只适用于供试品中结构相似、相对含量较高且限度范围较宽的杂质含量的粗略考查，如异构体相对含量的检查。
例如，枸橼酸氯米芬中有关物质的检查：取本品，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为供试品溶液。照高效液相色谱法测定，用硅胶为填充剂，以正己烷-三氯甲烷-三乙胺（80∶20∶1）为流动相（三乙胺用量可适当改变；必要时，三氯甲烷可用水分次洗涤，经无水硫酸钠干燥，临用新鲜蒸馏），检测波长为302nm，理论板数按顺式异构体峰计算不低于3000，顺、反式异构体峰的分离度应大于1.3。取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为顺式异构体（E）与反式异构体（Z）。按峰面积归一化法计算，供试品含反式异构体应为30%～50%。
用于杂质检查时，峰面积归一化法在杂质结构与主成分结构相差较大时可能会有较大的定量误差。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。
3. 气相色谱法
气相色谱法主要用于药物中挥发性杂质及有机溶剂残留量的检查。检查方法与高效液相色谱法相同。如樟脑（天然）中有关物质的检查，采用不加校正因子的主成分自身对照法进行检查。具体方法如下：
取本品约2.5g，精密称定，置25ml量瓶中，加正庚烷溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用正庚烷稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另取3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇与乙酸龙脑酯各适量，加正庚烷溶解并稀释制成每1ml中各约含0.5mg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液。照气相色谱法试验，以聚乙二醇20M （或极性相近）为固定液；起始温度为50℃，维持10min，以每分钟2℃的速率升温至100℃，再以每分钟10℃的速率升温至200℃，维持10min；进样口温度为220℃；检测器温度为250℃；取系统适用性试验溶液1μl，注入气相色谱仪，3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇峰与乙酸龙脑酯峰的分离度应大于2.0。精密量取供试品溶液和对照溶液各1μl，分别注入气相色谱仪。供试品溶液如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的2倍（2.0%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的4倍（4.0%）。
