实验五 细菌鉴定中常用的生理生化反应
一、实验目的
（1）了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法。
（2）通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多样性。
（3）了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。
（4）学习不同接种技术。
二、实验原理
不同细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质分解能力也不一样，因而代谢的产物存在差别，用生理生化实验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。
三、实验材料
1.菌株
大肠杆菌（Escherichia coli）、变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、产气杆菌（Enterobacter aerogenes）和未知菌悬液。
2.试剂
甲基红试剂，V-P试剂，吲哚试剂；葡萄糖/乳糖发酵培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，胰蛋白胨水培养基，硫化氢实验培养基，明胶液化培养基，柠檬酸盐培养基，淀粉培养基平板。
四、实验步骤
1.培养基配制
（1）葡萄糖/乳糖发酵培养基（用于糖发酵实验）
胰蛋白胨 5g
NaCl 2.5g
蒸馏水 500mL
制法：
①将上述成分混合于蒸馏水中溶解，校正pH至7.4～7.6。
②加葡萄糖/乳糖5g，溶解后加入0.5mL的1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，混匀。
③分装于60支试管内，每管5mL。
④每管倒置一个杜氏小管，加盖，115℃灭菌30min。
（2）葡萄糖蛋白胨水培养基（用于甲基红实验和V-P实验）
蛋白胨 2.5g
葡萄糖 2.5g
磷酸氢二钾 2.5g
蒸馏水 500mL
制法：
①将上述成分混合于蒸馏水中，加热溶解后，调pH至7.2。
②分装于120支试管中，每管5 mL。0.06MPa灭菌30min。
（3）胰蛋白胨水培养基（用于吲哚实验）
胰蛋白胨 5g
NaCl 2.5g
蒸馏水 500mL
制法：
①将上述成分混合于蒸馏水中溶解，校正pH至7.4～7.6。
②分装于60支试管中，每管5mL。0.06MPa灭菌30min。
（4）柠檬酸盐培养基（用于柠檬酸盐利用实验）
氯化钠 2.5g
硫酸镁 0.1g
磷酸氢二铵 0.5g
磷酸二氢钾 0.5g
柠檬酸钠 1g
琼脂 10g
1%溴麝香草酚蓝乙醇溶液 5mL
蒸馏水 500mL
制法：
①将上述各成分（溴麝香草酚蓝除外）加热溶解，校正至pH6.8。
②加入溴麝香草酚蓝混匀，分装60支试管，每管约5mL。
③0.1MPa高压灭菌20min后制成斜面。
（5）明胶培养基（用于明胶液化实验）
牛肉膏 2.5g
蛋白胨 5g
NaCl 2.5g
明胶 60g
蒸馏水 500mL
制法：
①将上述成分溶化，调pH7.2～7.4。
②加入明胶，分装到60支试管，每支5mL。
③0.06MPa、30min灭菌。
（6）硫化氢实验培养基（用于硫化氢实验）
蛋白胨 10g
NaCl 2.5g
柠檬酸铁铵 0.25g
硫代硫酸钠 0.25g
琼脂 4g
蒸馏水 500mL
制法：
①调pH至7.2后，用蒸馏水将琼脂加热溶解。
②分装到60支试管，0.1MPa灭菌20min后备用。
（7）淀粉培养基（用于淀粉水解实验）
蛋白胨 10g
牛肉膏 5g
可溶性淀粉 2g
NaCl 5g
琼脂 20g
蒸馏水 1000mL
制法：
①取少量蒸馏水将淀粉调成糊状，再加入到已溶化好的培养基中，定容到1000mL。
②调pH至7.2，分装于三角瓶，115℃、25min灭菌后冷却到60℃左右，无菌操作倒入无菌培养皿中制作平板培养基。
2.培养基的标记
用记号笔在试管上标明培养基的名称，所接种的菌名，和实验组号。
3.接种
取不同培养基，按照实验要求从相应细菌悬液中取菌接种。
4.对以下实验组进行相应处理后再观察结果
①甲基红实验：加甲基红试剂数滴。
②V-P实验：加入40% KOH 5～10滴后，再加入等量的α-萘酚溶液，在37℃恒温箱保温30min。
③吲哚实验：加数滴吲哚试剂。
④明胶液化实验，将3支试管放入4℃冰箱30min，取出后观察明胶液化情况。
⑤培养24h后，对糖类发酵实验，硫化氢实验，柠檬酸盐利用实验直接观察结果。
⑥在淀粉培养基平板上的不同区域滴加碘液，观察淀粉-碘液显色反应的结果。
五、结果与讨论
（1）在吲哚实验和硫化氢产生实验中细菌各分解哪种氨基酸？
（2）假设某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵实验应该出现怎样的结果？