任务七 大米中黄曲霉素B1的测定
（一）原理
样品中黄曲霉毒素B1经提取、浓缩、薄层分离后，在波长365 nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。薄层板上黄曲霉毒素B1的最低检出量为0.0004 μg，最低检出浓度为5 μg/kg。
（二）试剂
① 三氯甲烷。
② 正己烷或石油醚（沸程30～60℃或60～90℃）。
③ 甲醇。
④ 苯。
⑤ 乙腈。
⑥ 无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水。
⑦ 丙酮。
以上试剂①～⑦在试验时先进行一次试剂空白试验，如不干扰测定即可使用，否则需逐一进行重蒸。
⑧ 硅胶G：薄层色谱用。
⑨ 三氟乙酸。
⑩ 无水硫酸钠。
氯化钠。
苯-乙腈混合液：量取98 mL苯，加2 mL乙腈，混匀。
甲醇水溶液：55∶45。
黄曲霉毒素B1标准溶液。
黄曲霉毒素B1标准溶液制备方法如下。
a.仪器校正。测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素。准确称取25 mg经干燥的重铬酸钾（基准级），用硫酸（0.5+ 1000）溶解后并准确稀释至200 mL，相当于 c（K2Cr2O7 ）=0.0004 mol/L。再吸取25 mL此稀释液于50 mL容量瓶中，加硫酸（0.5+1000）稀释至刻度，相当于0.0002 mol/L溶液。再吸取25 mL此稀释液于50 mL容量瓶中，加硫酸 （0.5+1000）稀释至刻度，相当于0.0001 mol/L溶液。用1 cm石英杯，在最大吸收峰的波长 （接近350 nm处）用硫酸（0.5+1000）作空白，测得以上3种不同浓度溶液的吸光度，并按式（1）计算出以上3种浓度溶液的摩尔消光系数的平均值：
（1）
式中 E——重铬酸钾溶液的摩尔消光系数；
A1——测得重铬酸钾溶液的吸光度；
c——重铬酸钾溶液的物质的量浓度。
再以此平均值与重铬酸钾的摩尔消光系数值3160比较，即求出使用仪器的校正因素[式（2）]：
（2）
式中 f——使用仪器的校正因素；
E——测得的重铬酸钾摩尔消光系数平均值。
若f>0.95或f<1.05，则使用仪器的校正因素可略而不计。
b.黄曲霉毒素B1标准溶液的制备 准确称取1～1.2 mg黄曲霉毒素B1标准品，先加入2 mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100 mL，避光，置于4℃冰箱保存。该标准溶液约为10 μg/mL。用紫外分光光度计测此标准溶液的最大吸收峰波长及该波长的吸光度值[式（3）]。
（3）
式中 X1——黄曲霉毒素B1标准溶液的浓度，μg/mL；
A——测得的吸光度值；
f——使用仪器的校正因素；
M——黄曲霉毒素B1的摩尔质量，为312 g/mol；
E——黄曲霉毒素B1在苯-乙腈混合液中的摩尔消光系数，为19800 L/ （mol·cm）。
根据计算，用苯-乙腈混合液调到标准溶液浓度10.0μg/mL，并用分光光度计核对其浓度。
c.纯度的测定。取10 μg/mL黄曲霉毒素B1标准溶液5 μL ，滴加于涂层厚度0.25 mm的硅胶 G薄层板上，用甲醇-三氯甲烷（4+96）与丙酮-三氯甲烷（8+92）展开剂展开，在紫外灯下观察荧光的产生，必须符合以下条件：
在展开后，只有单一的荧光点，无其他杂质荧光点；
原点上没有任何残留的荧光物质。
黄曲霉毒素B1标准使用液。准确吸取1 mL标准溶液（10 μg/mL）于10 mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于10 μg黄曲霉毒素B1 。吸取1.0 mL此稀释液，置于5 mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度，此溶液每毫升相当于0.2 μg黄曲霉毒素B1 。再吸取黄曲霉毒素B1标准溶液（0.2 μg/mL）1.0 mL置于5 mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度，此溶液每毫升相当于0.04 μg黄曲霉毒素B1 。
次氯酸钠溶液（消毒用）。取100 g漂白粉，加入500 mL水，搅拌均匀。另将80 g工业用碳酸钠（Na2CO3·10H2O）溶于500 mL温水中，再将两液混合、搅拌，澄清后过滤。此滤液含次氯酸浓度约为25 g/L。若用漂粉精制备，则碳酸钠的量可以加倍。所得溶液的浓度约为 50 g/L。污染的玻璃仪器用10 g/L次氯酸钠溶液浸泡半天或用50 g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后，即可达到去毒效果。
重铬酸钾。
硫酸（0.5+1000）。
碳酸钠。
漂白粉。
（三）仪器
① 小型粉碎机。
② 样筛。
③ 电动振荡器。
④ 全玻璃浓缩器。
⑤ 玻璃板： 5 cm×20 cm。
⑥ 薄层板涂布器。
⑦ 展开槽：内长25 cm、宽6 cm、高4 cm。
⑧ 紫外灯： 100～125 W，带有波长365 nm的滤光片。
⑨ 微量注射器或血色素吸管。
⑩ 实验室常规仪器。
吹风机。
（四）分析步骤
1.取样
样品中若混有污染黄曲霉毒素含量高的霉粒，一粒就可以左右测定结果，而且有毒霉粒的比例小，分布不均匀，为避免取样带来的误差，必须大量取样，并将该大量样品粉碎，混合均匀，才有可能得到确能代表一批样品的相对可靠的结果。因此，采样应注意以下几点。
① 根据规定采取有代表性样品。
② 对局部发霉变质的样品检验时，应单独取样。
③ 小麦粉样品全部通过20目筛，混匀。必要时，每批样品可采取3份大样作样品制备及分析测定用，以观察所采样品是否具有一定的代表性。
2.提取
称取20.00 g过筛样品，置于250 mL具塞锥形瓶中，加30 mL正己烷或石油醚和100 mL甲醇水溶液，在瓶塞上涂一层水，盖严防漏。振荡30 min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。取 20.00 mL甲醇水溶液（相当于4 g样品）置于另一125 mL分液漏斗中，加20 mL三氯甲烷，振摇2 min，静置分层，如出现乳化现象可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10 g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于50 mL蒸发皿中，再加5 mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风柜中于65℃水浴上通风挥干，然后放在冰盒上冷却2～3 min后，准确加入1 mL苯-乙腈混合液（或将三氯甲烷用浓缩蒸馏器减压吹气蒸干后，准确加入1 mL苯-乙腈混合液）。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移于2 mL具塞试管中。
3.测定
（1）单向展开法
①薄层板的制备。称取约3 g硅胶G，加相当于硅胶量2～3倍左右的水，用力研磨1～2 min 至成糊状后立即倒于涂布器内，推成5 cm×20 cm、厚度约0.25 m的薄层板三块。在空气中干燥 约15 min后，在100℃活化2 h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2～3 d，若放置时间较长，可再活化后使用。
②点样。将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3 cm的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距约为1 cm，点直径约3 mm。在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。滴加样式如下。
第一点：10 μL黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04 μg/mL）。
第二点：20 μL样液。
第三点：20 μL样液+10 μL 黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04 μg/mL）。
第四点： 20μL样液+10 μL 黄曲霉毒素B1标准使用液（0.2 μg/mL）。
③ 展开与观察。在展开槽内加10 mL无水乙醚，预展12 cm，取出挥干。再于另一展开槽内加10 mL丙酮-三氯甲烷（8+92），展开10～12 cm，取出。在紫外光下观察结果，方法如下。
a.由于样液点上加滴黄曲霉毒素B1标准使用液，可使黄曲霉毒素B1标准点与样液中的黄曲霉毒素B1荧光点重叠。如样液为阴性，薄层板上的第三点中黄曲霉毒素B1为0.0004 μg，可用作检查在样液内黄曲霉毒素B1最低检出量是否正常出现；如为阳性，则起定性作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B1为0.002 μg，主要起定位作用。
b.若第二点在与黄曲霉毒素B1标准点的相应位置上无蓝紫色荧光点，表示样品中黄曲霉毒素B1含量在5 μg/kg以下；如在相应位置上有蓝紫色荧光点，则需进行确证试验。
④ 确证试验。为了证实薄层板上样液荧光系由黄曲霉毒素B1产生的，加滴三氟乙酸，产生黄曲霉毒素B1的衍生物，展开后此衍生物的比移值约在0.1。于薄层板左边依次滴加两个点。
第一点： 10 μL黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04 μg/mL）。
第二点： 20 μL样液。
于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5 min后，用吹风机吹热风2 min后，使热风吹到薄层板上的温度不高于40℃。
再于薄层板上滴加以下两个点。
第三点： 10 μL 黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04 μg/mL）。
第四点： 20 μL样液。
再展开（同③），在紫外灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素B1标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。
⑤ 稀释定量。样液中的黄曲霉毒素B1荧光点的荧光强度如与黄曲霉毒素B1标准点的最低检出量（0.004 μg）的荧光强度一致，则样品中黄曲霉毒素B1含量即为5μg/kg。如样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少滴加量或将样液稀释后再滴加不同量，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下。
第一点： 10 μL黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04 μg/mL）。
第二点：根据情况滴加10 μL样液。
第三点：根据情况滴加15 μL样液。
第四点：根据情况滴加20 μL样液。
⑥ 计算：样品中黄曲霉毒素B1的含量按式（4）计算。
（4）
式中 X2——样品中黄曲霉毒素B1的含量，μg/kg；
V1——加入苯-乙腈混合液的体积，mL；
V2——出现最低荧光时而加样液的体积，mL；
D ——样液的总稀释倍数；
m——加入苯-乙腈混合液溶解时相当样品的含量，g；
0.0004——黄曲霉毒素B1的最低检出量，μg。
结果表述：报告测定值的整数位。
（2）双向展开法 如用单向展开法展开后，薄层色谱由于杂质干扰掩盖了黄曲霉毒素B1的荧光强度，需采用双向展开法。薄层板先用无水乙醚作横向展开，将干扰的杂质展至样液点的一边而黄曲霉毒素B1不动，然后再用丙酮、三氯甲烷（8+92）作纵向展开，样品在黄曲霉毒素B1相应处的杂质底色大量减少，因而提高了方法灵敏度。如用双向展开中滴加两点法展开仍有杂质干扰时，则可改用滴加一点法。
①滴加两点法
a.点样。取薄层板3块，在距下端3 cm基线上滴加黄曲霉毒素B1标准使用液与样液。即在3块板的距左边缘0.8～1 cm处各滴加10 μL黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04 μg/mL），在距左边缘2.8～3 cm处各滴加20 μL样液，然后在第二块板的样液点上加滴10 μL 0.04 μg/mL黄曲霉毒素B1标准使用液，在第三块板的样液点上加滴10 μL 黄曲霉毒素B1标准使用液（0.2 μg/mL）。
b.展开。
横向展开。在展开槽内的长边置一玻璃支架，加10 mL无水乙醇，将上述点好的薄层板 靠标准点的长边置于展开槽内展开，展至板端后，取出挥干，或根据情况需要时可再重复展开 1～2次。
纵向展开。挥干的薄层板以丙酮-三氯甲烷（8+92）展开至10～12 cm为止。丙酮-三氯甲烷的比例根据不同条件自行调节。
c.观察及评定结果。在紫外灯下观察第一、二板，若第二板的第二点在黄曲霉毒素B1标准点的相应处出现最低检出量，而第一板在与第二板的相同位置上未出现荧光点，则样品中黄曲霉毒素B1含量在 5 μg/kg以下。
若第一板在与第二板的相同位置上出现荧光点，则将第一板与第三板比较，看第三板上 第二点与第一板上第二点的相同位置上的荧光点是否与黄曲霉毒素B1标准点重叠，如果重叠，再进行确证试验。在具体测定中，第一、二、三板可以同时做，也可按照顺序做。如按顺序做，当在第一板出现阴性时，第三板可以省略，如第一板为阳性，则第二板可以省略，直接做第三板。
d.确证试验。另取薄层板两块，于第四、五两板距左边缘0.8～1 cm处各滴加10 μL黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04 μg/mL）及1小滴三氟乙酸；在距左边缘2.8～3 cm处，于第四板滴加 20 μL样液及1小滴三氟乙酸；于第五板滴加20 μL样液、10μL黄曲霉毒素B1标准使用液 （0.04 μg/mL）及1小滴三氟乙酸。反应5 min后，用吹风机吹热风2 min，使热风吹到薄层板上的温度不高于40℃，再用双向展开法展开后，观察样液是否产生与黄曲霉毒素B1标准点重叠的衍生物。 观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。如样液黄曲霉毒素B1含量高时，则将样液稀释后，按（1）④做确证试验。
e.稀释定量。如样液黄曲霉毒素B1含量高时，按（1）⑤稀释定量操作。如黄曲霉毒素B1含量低，稀释倍数小，在定量的纵向展开板上仍有杂质干扰，影响结果的判断，可将样液再做双向展开法测定，以确定含量。
f.结果计算。同（1）⑥。
②滴加一点法。
a.点样。取薄层板3块，在距下端3 cm基线上滴加黄曲霉毒素B1标准使用液与样液。即在3块板距左边缘0.8～1 cm处各滴加20 μL样液，在第二板的点上加滴10 μL黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04 μg/mL），在第三板的点上加滴10 μL黄曲霉毒素B1标准溶液（0.2 μg/mL）。
b.展开。同①b的横向展开与纵向展开。
c.观察及评定结果。在紫外灯下观察第一、二板，如第二板出现最低检出量的黄曲霉毒素B1标准点，而第一板与其相同位置上未出现荧光点，则样品中黄曲霉毒素B1含量在5 μg/kg以下。如第一板在与第二板黄曲霉毒素B1相同位置上出现荧光点，则将第一板与第三板比较，看第三板上与第一板相同位置的荧光点是否与黄曲霉毒素B1标准点重叠，如果重叠，再进行以下确证试验。
d.确证试验。另取两板，于距左边缘0.8～1 cm处，第四板滴加20 μL样液、1滴三氟乙酸；第五板滴加20 μL样液、10 μL 黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04 μg/mL）及1滴三氟乙酸，产生衍生物及展开方法同①d。再将以上二板在紫外灯下观察，以确定样液点是否产生与黄曲霉毒素B1标准点重叠的衍生物，观察时可将第一板作为样液的衍生物空白板。经过以上确证试验确定为阳性后，再进行稀释定量，如黄曲霉毒素B1含量低，不需稀释或稀释倍数小，杂质荧光仍有严重干扰，可根据样液中黄曲霉毒素B1荧光的强弱，直接用双向展开法定量。
e.结果计算。同（1）⑥。