实验三 果蝇的单因子杂交实验
【实验目的】
（1）验证并加深理解孟德尔分离定律；
（2）掌握果蝇杂交实验技术；
（3）学习遗传学实验结果记录及统计处理方法。
【实验原理】
基因在生物中成对存在，具有显隐性之分，显性基因决定显性性状，隐性基因决定隐性性状，这样的一对基因称为等位基因（allele），位于一对同源染色体的相同座位上。单因子杂交是指决定某一性状的一对等位基因间的杂交。孟德尔分离定律指出，一对杂合状态的等位基因，在遗传上保持相对的独立性，在形成配子时，分离到不同的配子中去，理论上配子分离比为1∶1，子二代基因型比为1∶2∶1；若完全显性，子二代表型分离比为3∶1。
果蝇长翅（野生型）和残翅（突变型）是一对相对性状，受一对等位基因控制，长翅对残翅为显性性状。当野生型长翅（+/+）和突变型残翅（vg/vg）杂交时，F1都是长翅；F1的雌雄蝇进行兄妹杂交后，F2性状分离出两种表型，即长翅和残翅，其比例为3∶1（图3-1）。
图3-1 单因子杂交实验原理
【实验用品】
1.实验材料
本实验所用到的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）品系为野生型长翅果蝇（+/+），翅长超过尾部；突变型残翅果蝇（vg/vg）的双翅几乎没有，只留少量残痕，无飞翔能力。长翅基因座是Ⅱ67.0，长翅对残翅为完全显性。
2.实验器具
恒温培养箱、高压灭菌锅、白瓷板、镊子、毛笔、果蝇培养瓶、麻醉瓶、脱脂棉、医用纱布、标签纸、牛皮纸、棉线绳、橡皮筋、酒精灯等。
3.试剂
琼脂、蔗糖、玉米粉、酵母粉、丙酸（装在滴瓶中）、乙醚等。
【实验步骤】
1.原种果蝇培养
实验室于杂交实验开始前2周，在25℃条件下分别培养长翅和残翅果蝇品系。待每个培养瓶中的幼虫化蛹之后，移去培养瓶中的成蝇，准备挑选杂交亲本。
2.收集亲本处女蝇
选野生型（长翅）和残翅果蝇为亲本。由于雌蝇生殖器官中有贮精囊，一次交配可保留大量精子供多次排卵受精用，因此，做杂交实验前必须收集未交配过的处女蝇。
刚羽化的雌蝇在12h内一般无交配能力，因此在杂交实验开始前放出亲本培养瓶中的所有成蝇，然后每隔8～10h收集一次刚羽化出的成蝇，并将雌雄蝇分开在不同的培养瓶中培养。收集处女蝇数量的多少根据需要而定，通常每组合不少于5只。
3.设计杂交组合，进行麻醉接种
选用野生型长翅果蝇与残翅果蝇杂交，正反交实验同时进行，即长翅♀×残翅♂、残翅♀×长翅♂。将所选处女蝇按品系分别麻醉，按不同杂交组合分别选取雌、雄蝇各6～10只移入杂交瓶中，为了防止昏迷果蝇被培养基粘住，可将培养瓶放倒，将果蝇置于瓶壁，待其完全苏醒后再将培养瓶直立，贴上标签（图3-2），标明杂交亲本、杂交日期、实验人姓名。将杂交瓶放在25℃恒温箱内培养。
图3-2 果蝇单因子杂交标签示意图
4.实验观察
（1）培养7天后当培养瓶中出现幼虫时，应及时将亲本移出处死，以防止亲本与F1代成蝇发生回交。再经3～5天F1代成虫开始羽化，观察F1代成蝇表型并做记录，连续检查2～3天或在释放亲本7天后集中观察。观察后的果蝇收集至尸体瓶。理论上F1代个体的表型均为野生型。
（2）选取正反交各6～10对F1代雌雄果蝇，分别移入新培养瓶（不需要处女蝇），贴好标签，写明F1代的基因型、班级、姓名、杂交日期等信息。放到25℃恒温箱内培养。当看到培养瓶内大量出现幼虫时，及时将亲本处死，以防发生回交。
（3）过3～5天，F2代成蝇出现后，进行观察统计。可连续统计4～5天，以保证各杂交后代的统计数目大于200只，已被观察统计过的果蝇要倒入尸体瓶。按照所配制的正反交组合，提出理论假设并根据实验结果进行χ2检验。
【实验数据处理与分析】
（1）观察并统计正、反交F1代、F2代的表型及个体数，比较正反交结果，完成表3-1。
表3-1 果蝇单因子杂交实验数据统计
（2）根据统计结果，对该实验F2代的统计数据做χ2检验，完成表3-2。
表3-2 单因子杂交F2代数据的χ2检验
注：自由度=n-1=1；χ2=∑（O-E）2/E。
（3）观察并统计F1代的表型及个体数，分析基因间的显隐性关系。观察并统计F2代的表型及各种表型的个体数，计算不同表型个体数的比例，对该实验F2代的统计结果做χ2测验。
查附录8，若所计算的χ2<
（查表），表明实验观察数与预期数之间无显著性差异，说明实验观察数符合理论假设；若所得的χ2>
（查表），说明实验观察数与预期数差异显著，不符合理论假设。
【要点及注意事项】
（1）严格控制挑选处女蝇的时间，挑选的处女蝇最好单独培养2～3天，如果有幼虫出现，说明有非处女蝇混杂。
（2）观察和统计F1代、F2代果蝇时，要先对果蝇进行深度麻醉，再进行观察统计。特别是观察翅型时，尽量避免果蝇死亡导致翅膀外展而干扰观察。
（3）乙醚是神经麻醉剂，果蝇的麻醉操作应在有通风装置的实验室中进行。
【作业及思考题】
（1）如果分别对F1代、F2代的雌雄果蝇进行统计分析，分离规律的验证结论有无不同？
（2）纯合亲本杂交时需选择处女蝇，那么F1代雌雄个体间杂交是否还需要选择处女蝇？为什么？
（3）正反交的实验结果必然相同吗？如果正反交的结果不一致，可能的原因是什么？
【参考文献】
[1] 闫桂琴，王华峰.遗传学实验教程[M].北京：科学出版社，2010.
[2] 杨大翔.遗传学实验[M].第3版.北京：科学出版社，2016.
[3] 牛炳韬，孙英莉.遗传学实验教程[M].兰州：兰州大学出版社，2014.
（唐文武 梁盛年）