第一部分　经典遗传学实验

实验一　果蝇的野外采集、饲养及生活史

【实验目的】

（1）学习果蝇的实验室饲养管理、培养基的配制等方法；

（2）了解并掌握果蝇麻醉、接种等实验操作相关技术；

（3）了解果蝇生活史的各个发育阶段的形态特点。

【实验原理】

果蝇（fruit fly）是遗传学实验中最常用的动物，属于双翅目（Diptera）的果蝇属（Drosophila），在全世界范围均有分布，估计有3000多种，遗传学研究中通常用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）。果蝇作为遗传材料具有很多突出的优点：①染色体数目少，2n=8；②突变性状多，而且多数是形态突变，便于观察；③世代周期短，在25℃下10天可完成一个世代；④个体小，易于饲养，培养费用低廉；⑤繁殖能力强，每个受精雌蝇可产卵400～500个，可以产生较大的子代群体供观察、统计及遗传分析。自1909年摩尔根（Thomas H.Morgan）开始用果蝇做遗传学实验，之后30余年时间里，他与他的学生、同事利用这种昆虫解决了一系列重大的遗传学问题。摩尔根等的成功，很大一部分得益于他的选材。正因为如此，果蝇至今仍是遗传学、细胞学、发育生物学等研究中一种很好的遗传学实验材料，是一种模式生物。

【实验用品】

1.实验材料

黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）。

2.实验器具

恒温培养箱、体视显微镜、高压灭菌锅、白瓷板、镊子、毛笔、解剖针、果蝇培养瓶（三角瓶和中指管）、脱脂棉、医用纱布、标签纸、牛皮纸、棉线绳、橡皮筋、酒精灯等。

3.试剂

琼脂、蔗糖、玉米粉、酵母粉、丙酸（装在滴瓶中）、乙醚等。

【实验步骤】

1.果蝇的野外采集

果蝇是一种常见昆虫，尤其是在夏天极易采集，可用培养瓶放于水果摊附近进行采集，也可在一个空瓶子中放入一些发酵的水果（如酸败的香蕉或菠萝），引诱果蝇。待果蝇进入瓶中，用瓶塞快速盖上瓶口，带回实验室转接到装有培养基的培养瓶里进行培养观察。

2.果蝇的培养

（1）培养瓶的灭菌　培养果蝇用的培养瓶可用三角瓶或大、中型指管，用纱布包的棉花球作瓶塞。实验室中保存原种以中指管为宜，果蝇杂交或继代培养可用三角瓶。培养瓶用前要灭菌消毒，以防止真菌污染和果蝇混杂。灭菌的方法是：将带棉塞的培养瓶在160℃的恒温干燥箱中干热灭菌2h；或在高压蒸汽灭菌锅中，在121℃、1kgf/cm2（98.0665kPa）气压下灭菌15～20min，干燥后待用。

（2）果蝇培养基的配制　酵母菌是果蝇的主要食物，实验室内凡能发酵的物质都可成为培养基，国内使用的培养基包括香蕉、玉米粉、米粉等不同类型，其配制方法见附录1。以最常用的玉米粉培养基的配制为例，按表1-1称取玉米粉、蔗糖、琼脂。取应加水的一半，加入琼脂加热溶解，水开后加入蔗糖，搅拌均匀。将玉米粉加入剩余的另一半水中，搅拌均匀，再将蔗糖琼脂溶液慢慢加入，边加边搅拌（这样玉米粉不易结块）。继续煮5～10min，直至培养基成为一种糊状物时离火。稍微冷却后加入丙酸（用于防腐）及酵母粉，搅拌均匀即可分装。分装时每瓶培养基厚约2cm，室温下干燥2～3天，待培养基完全凝固后再行接种。

果蝇的培养基一般不需要灭菌，配制和分装在非无菌条件下进行即可。在南方湿热气候下，培养基可能出现污染，可考虑将培养基进行灭菌处理。按上述方法配制并分装培养基后，盖上棉塞并用牛皮纸包扎封口，用高压灭菌锅在121℃、1kgf/cm2下灭菌15min，取出待冷却干燥后使用。

（3）果蝇的麻醉和接种　为了便于细致观察，须将果蝇进行麻醉处理，可使用专用的麻醉瓶，或者以适当大小的广口瓶代用，在广口瓶中加一木塞，木塞下面钉上一团用纱布包好的棉球即成。

麻醉时，先取下麻醉瓶塞倒立放在瓶侧，再取培养瓶轻拍瓶壁，使果蝇落在培养瓶底部，用右手两指取下培养瓶的棉塞（夹在指间不要放在台上），迅速和麻醉瓶口对接紧密，左手握紧两瓶口稍微倾斜，右手轻拍培养瓶将果蝇振落麻醉瓶中，然后迅速盖好两个瓶塞。或者培养瓶在下、麻醉瓶在上，去塞对接中，达到一定数量后，迅速分别盖好两个瓶口。

如果用自制的麻醉瓶，可在瓶塞的棉花团上先加几滴乙醚，随即迅速塞紧瓶口，果蝇对乙醚很敏感，易麻醉，约经半分钟，果蝇便被麻醉，麻醉的深度看实验要求而定（作种蝇以轻度麻醉为宜，做观察时可深度麻醉，致死也无妨），之后可倾倒在用酒精擦过的白瓷板上进行观察，当发现果蝇苏醒时，可用一条吸水纸加几滴乙醚贴在培养皿内盖住果蝇，再次麻醉。注意勿使麻醉过度，如果蝇翅外展与身体呈45°角，即双翅垂直时，表明已麻醉致死不能复苏。

将麻醉的果蝇倾倒在干净的白瓷板上，利用解剖针或小毛笔轻轻地拨动，进行性状的观察与鉴定。或将麻醉的果蝇移入新的培养瓶，接种时应将瓶横卧，用毛笔将果蝇轻轻挑入，待其苏醒后再将培养瓶竖起，防止果蝇粘在培养基上导致死亡。

（4）果蝇培养　温度对果蝇的生长发育影响很大，25℃是最适宜的生长温度，30℃以上的高温则可能导致果蝇死亡，在10～20℃环境中生活周期延长，低于10℃则可能影响生活力。我们可利用此特性调节果蝇生长的速度，控制其群体的大小。如原种培养时可将培养瓶置于18～19℃下培养；杂交实验应需要较大的群体，则可将培养温度设为25℃。培养时应避免日光直射。

原种培养每2～4周换一次培养基，每一原种至少保留两套，接种之前应先麻醉果蝇，检查有无混杂，一般每瓶接5～10对种蝇。培养瓶外贴标签，注明品系名称、接种日期等信息。

3.果蝇的生活史观察

果蝇属完全变态的昆虫，一个完整的生活周期可分为卵、幼虫、蛹和成虫4个明显的时期（图1-1）。果蝇的生活周期长短与温度有密切的关系，在25℃下，从卵到成蝇只需10天左右。成蝇在交配1～2天后即可产卵，受精卵在24h内可孵化成幼虫，幼虫经过两次蜕皮成为三龄幼虫，其体长可达4～5mm。幼虫生活4天左右开始化蛹，化蛹前三龄幼虫会停止摄食，并爬到相对干燥的表面（如培养瓶壁）上，逐渐形成一个菱形的蛹。成熟蛹壳中羽化出来的果蝇8～12h后即可进行交配，交配后精子可在雌蝇的受精囊中贮存一段时间，然后逐渐释放到输卵管中，所以果蝇杂交实验中母本必须选用未交配的雌蝇（处女蝇）。

（1）卵　成熟的雌蝇交尾后（2～3天）将卵产在培养基的表层。用解剖针的针尖在培养基表面挑取一点培养基置于载玻片上，滴加一滴清水进行稀释，在解剖镜下仔细观察。果蝇的卵长约0.5mm，为椭球形，腹面稍扁平，在背面的前端伸出一对触丝，它能使卵附着在培养基表面而不陷入深层。

（2）幼虫　受精卵经过1天的发育即可孵化为幼虫，经过两次蜕皮发育成三龄幼虫，其体长可达4～5mm。幼虫随着发育而不断长大，三龄幼虫往往爬到瓶壁上来化蛹。在实验室中，可利用体视显微镜观察幼虫的形态，可见其一端稍尖为头部，并且有一黑点即口器；稍后有一对半透明的唾腺，每条唾腺前有一条唾腺管向前延伸，然后会合成一条导管通向消化道。幼虫的活动力强而贪食，在培养基上爬过时便留下一道沟，沟多而宽时，表明幼虫生长良好。

（3）蛹　幼虫经过4～5天的发育开始化蛹。化蛹前三龄幼虫从培养基中爬出附在瓶壁上，渐次形成一个菱形的蛹。起初颜色淡黄、柔软，以后逐渐硬化，为深褐色，显示即将羽化。培养瓶壁上可见大量几乎透明的蛹，这些是羽化后遗留下的蛹的空壳。

（4）成虫　刚羽化出的果蝇虫体狭长，翅膀也没有完全展开，体表未完全几丁质化，色浅，呈半透明的乳白色，通过腹部体壁还可以看到黑色的消化系统和性腺。随着发育的继续，蝇体变成粗短椭圆形，双翅展开，身体颜色加深。羽化后的果蝇在8～10h后开始交配，成虫果蝇在25℃条件下的寿命为37天。

【要点及注意事项】

（1）为保证安全，高压蒸汽灭菌锅使用时一定要在老师的指导下进行。

（2）配制培养基时，煮沸后应保持沸腾几分钟，使培养基呈黏稠的糊状物，否则，培养基容易稀松发霉。

（3）加入丙酸时注意屏住呼吸，防止酸遇热挥发，刺激呼吸道。

（4）麻醉时注意掌握深度，防止麻醉过度而导致死亡或发育异常。

【作业及思考题】

（1）配制果蝇玉米培养基时应注意什么问题？

（2）果蝇对光有反应吗？请设计小实验加以证明，并把现象记录下来。

（3）果蝇的生活史分几个阶段，你所观察到的果蝇在整个生活史各阶段有什么差异？

【参考文献】

[1] 牛炳韬，孙英莉.遗传学实验教程[M].兰州：兰州大学出版社，2014.

[2] 杨大翔.遗传学实验[M].第3版.北京：科学出版社，2016.

[3] 闫桂琴，王华峰.遗传学实验教程[M].北京：科学出版社，2010.

（唐文武　梁盛年）