实验九 果蝇唾腺染色体的制备与观察
【实验目的】
（1）了解果蝇唾腺的形态学及遗传学特征；
（2）掌握分离果蝇幼虫唾腺的技术；
（3）掌握果蝇唾腺染色体的制片方法；
（4）观察唾腺染色体结构特征并绘制染色体图。
【实验原理】
双翅目昆虫的整个消化道细胞发育到一定阶段后就不再进行有丝分裂，而停止在分裂间期。但随着幼虫整体器官以及这些细胞本身体积的增大，细胞核中的染色体，尤其是唾腺染色体仍不断地进行自我复制而不分开，经过许多次的复制形成约1000～4000拷贝的染色体丝，合起来达5μm宽，400μm长，比普通中期相染色体大得多（约100～150倍），所以又称多线染色体（polytene chromosome）和巨大染色体（giant chromosome）。这些巨大的唾腺染色体具有许多重要特征，为遗传学研究的许多方面，如染色体结构、化学组成、基因差别表达等提供了独特的研究材料。
唾腺染色体的另外一个特点是体细胞中同源染色体处于紧密配对状态，这种状态称为“体细胞联会”。在以后不断的复制中仍不分开，由此成千上万的核蛋白纤维丝结合在一起，紧密盘绕。所以细胞中染色体只呈单倍数。黑腹果蝇的染色体数目2n=8，其中第Ⅱ、第Ⅲ染色体为中部着丝粒染色体，第Ⅳ和第Ⅰ（X染色体）染色体为端着丝粒染色体。唾腺染色体形成时，染色体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚于一起形成一个染色体中心，所以在光学显微镜下可见染色中心伸出6条配对的染色体臂，其中5条为长臂，1条为紧靠染色体中心的很短的臂。
唾腺染色体经染色后，呈现颜色深浅不同、疏密各异的横纹。这些横纹的数目、位置、宽窄及排列顺序都具有物种的特异性。研究认为这些横纹与染色体的基因是有一定关系的。从其横纹分布特征可对物种的进化特征进行比较，而一旦染色体上发生了缺失、重复、倒位、易位等结构变化，也可较容易地在唾腺染色体上观察识别出来。
【实验用品】
1.实验材料
黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）野生型或任何突变型的三龄幼虫。
2.实验器具
显微镜、体视显微镜、解剖针、镊子、载玻片、盖玻片、滤纸条等。
3.试剂
卡宝品红染液、生理盐水（0.85%）、蒸馏水等。卡宝品红染液的配制方法见附录2。
【实验步骤】
1.三龄幼虫的饲养
将5～10对果蝇接种到加有酵母菌的培养瓶中进行培养，2～3天后清除亲蝇。当培养瓶中出现幼虫后，在培养基表面追加低浓度的酵母液（2%～4.5%的酵母水溶液），每天滴加1～2滴。三龄幼虫（图9-1）期适当增加酵母液的浓度（10%左右）。滴加量以盖上培养基表面一层为准，以改善果蝇的营养条件。同时，低温培养（16～18℃）有利于幼虫的充分生长发育，以获得个体较大、结构清晰、有利于解剖的个体。
图9-1 果蝇三龄幼虫
2.剥取唾腺
从培养瓶中挑选肥大的、接近化蛹的三龄幼虫置于干净的载玻片上，先用蒸馏水反复冲洗幼虫，将其表面杂质冲洗干净，最后滴一滴生理盐水浸泡幼虫，但量不可过多，然后将载玻片置于体视镜下。取两根解剖针，一根扎住口器，一根扎在幼虫前端1/3处，两针向两个方向迅速拉开，使其从头部断开，唾腺随之而出。唾腺是一对透明的上小下大的囊状结构，上面附着白色的脂肪条（在底光源和顶光源下观察），仔细观察可发现是由一个个较大的唾腺细胞组成的。三龄幼虫及唾腺的形态见彩图9-2。
彩图9-2 果蝇睡腺的剥离
用解剖针将不需要的组织挑除，细心剔除脂肪体，再把唾腺周围的杂物用吸水纸清理干净。注意此时动作应放慢，因唾腺很小，容易随水流的移动而进入到吸水纸中。
3.染色及压片观察
染色采用常规的方法，即载玻片上滴加一滴卡宝品红染液，染色5～10min。
将染色后的载玻片放在实验台板上，盖上盖玻片，用解剖针柄螺旋形由中间到四周，轻轻地敲击盖玻片，使细胞分散，染色体平展；再用两层滤纸覆盖在盖玻片上，用两个拇指垂直用力按压，注意要有一定的力度，且盖玻片与载玻片之间不能滑动，否则会造成染色体的扭曲断裂。将制好的片子先在低倍镜下观察，选取染色体分散较好的细胞放于高倍镜下观察。
【预期实验结果辨析】
果蝇唾腺细胞因同源染色体配对，其中4号染色体和X染色体是端着丝粒染色体，而2号、3号染色体是中央着丝粒染色体，因此，显微镜下果蝇巨大唾腺染色体是从染色中心向四周放射性伸出5长1短共6条臂。其中1号染色体（X染色体）的一端在染色体中心上，另一端游离；2号、3号染色体从染色中心以V字形向外伸出，形成2L、2R、3L、3R四条臂；4号染色体很短小，呈点状负载染色中心边缘。巨大唾腺染色体每条臂端部的横纹、蓬突等特征是特定的，且各条不同。我们可根据以下特征来辨别每条臂。
①第4染色体臂非常小，特征不明显，其上的带纹很难看清，形态似乎也在变化；它夹在几条臂末端及染色中心中，不易与周围的组织相区分。②X染色体头像导弹，这个导弹头有时呈球形，导弹头下面2B位上有一个永久性的蓬突，这个蓬突可能较导弹头大，也有可能与其一样大，这是X染色体最突出的特征。③2L头部像一把紫砂壶，“壶盖”有时很清晰，有时则不明显。④2R的情况比较复杂。它的头部有一种形状，也像紫砂壶，与2L头相似。但是“壶盖底”的着色很深，另一种形状则与3R头非常相似。⑤3L头部像一顶僧帽，帽顶的细节不尽相同。在一些细胞中，这顶僧帽会变成各种大小的扇形帽。但是，无论帽子如何变，在普通光学显微镜下，帽子下的6个位置上可以非常稳定地看到深染的纹。⑥3R头部扇形展开时，也像一朵鸡冠花。区别于2R、3R头部末端呈展开状态时。见图9-2。
图9-2 果蝇唾腺染色体
【要点及注意事项】
（1）分离果蝇唾腺时，一定要滴加生理盐水，否则唾腺易干；但也不能滴加太多，否则幼虫会漂浮且活跃。
（2）剥离唾腺后，用滤纸吸水时应注意勿将唾腺一起吸走。
（3）染色时间不可过长，以免背景着色过深而影响观察鉴定。
（4）压片时受力盖玻片要均匀，用时要防止盖玻片移动而导致染色体断裂。
【作业及思考题】
（1）本次实验对实验材料有何要求，为什么？
（2）通过反复实践，你认为该实验的关键步骤是什么？
【参考文献】
[1] 杨大翔.遗传学实验[M].第3版.北京：科学出版社，2016.
[2] 牛炳韬，孙英莉.遗传学实验教程[M].兰州：兰州大学出版社，2014.
[3] 闫桂琴，王华峰.遗传学实验教程[M].北京：科学出版社，2010.
（唐文武 梁盛年）