第三篇　红茂草药用成分的提取、分离及鉴定

5　红茂草中的生物碱

5.1　红茂草生物碱提取方法及指纹检测技术的建立

5.1.1　材料与方法

（1）材料

①样品

采集规范化种植的红茂草，用保鲜袋封袋，立即带回实验室，将材料洗净，自然风干，60℃烘箱中烘干至恒重，粉碎后过80目筛，将样品放入磨口广口瓶，置于干燥器中保存、备用。

②仪器与试剂

WD-9403D型紫外分析仪（北京市六一仪器厂）；KD-1.2KD型组合式数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；凝胶层析系统（8823B-紫外检测仪、MCR-R微电自动仪、HL-2恒流泵）；UV-2450紫外-可见分光光度计（日本岛津）。

红茂草生物碱对照品　本室制备、保存，批号20010620，浓度20mg/mL、CMC（羧甲基纤维素钠）、薄层层析硅胶G（分析纯，青岛海洋化工有限公司生产）、sephadex G-50（购于Amersham-Pharmacia公司），氯仿、氨水、乙酸乙酯、甲酸、乙醇、冰乙酸、丙酮、苯均为分析纯，其余试剂均为国产或进口分析纯。

（2）方法

①生物碱的提取

a.水溶法提取生物碱　精密称取12.5g红茂草粉，溶于400mL水中，置于密封的玻璃容器中，用超声波清洗器处理1h。抽滤药渣，煎熬浓缩至糖浆状，加乙醇至75%，静置沉淀24h后过滤、蒸馏，调pH值至7.0。用0.1%活性炭脱色，沉淀24h过滤，定容至100mL，分装后高压柜灭菌，室温保存备用。

b.醇溶法提取生物碱　精密称取12.5g红茂草粉，溶于400mL 75%的乙醇溶液中，置于密封的玻璃容器中，用超声波清洗器处理1h抽滤药渣，滤液蒸馏至无醇味。然后加无水乙醇至85%，静置沉淀24h后过滤，滤液用1mol/L NaOH调pH值至8.0，沉淀、过滤、蒸馏至无醇味，用HCl调pH值至7.0。用0.1%活性炭脱色，沉淀24h过滤，定容至100mL，分装后高压柜灭菌，室温保存备用。

②红茂草生物碱粗提率测定

将提取过程中的药渣减压抽滤近干，取出自然干燥，称其质量，得红茂草生物碱粗提率。

③最大吸收光谱波长的选择

精密量取对照品溶剂和样品溶剂100μL置于10mL的容量瓶中，加无离子水定容至10mL，以无离子水为空白对照，在UV-2450紫外-可见分光光度计上于190～500nm波长范围内扫描，确定红茂草总生物碱的最大吸收波长。

④标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.20mL、0.25mL、0.3mL、0.35mL，分别置于试管中，加无离子水稀释至10mL，摇匀，使成为浓度分别为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL的梯度溶液，以无离子水为空白对照，测定OD210值。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标，作标准曲线。

⑤样品含量测定

在1～6号试管内，分别加入100μL提取液，均稀释至10mL，测定红茂草提取液吸光度，对照标准曲线，得出提取液生物碱的浓度。

⑥红茂草中生物碱的分离

a.凝胶柱层析　按常规法装Sephadex G-50柱后，用0.9%NaCl洗脱平衡，缓慢地加入红茂草试样100μL，控制流速1mL/min，根据光谱变化依次收集各组分。

b.薄层层析

ⅰ.薄层层析板的制备　称取CMC 0.15g、KOH 0.85g溶于30mL蒸馏水中，待其完全溶解后，加入硅胶G，边加边搅拌，使黏度适中。搅匀，置于平整的层析板上，室温风干后，置于50～60℃烘箱中烘干0.5h，然后将温度调到110℃进行活化1h。

ⅱ.展开剂的筛选　以展开系统Ⅰ[V无水乙醇∶V冰乙酸：V水（3∶0.1∶1）]、展开系统Ⅱ[V甲醇∶V冰乙酸∶V水（13∶0.5∶7）]、展开系统Ⅲ[V氯仿∶V甲醇∶V浓氨试液（5∶0.6∶0.2）]、展开系统Ⅳ[V苯∶V丙酮∶V甲醇（8∶3∶0.5）]、展开系统Ⅴ[V乙酸乙酯∶V丙酮∶V苯∶V浓氨试液（4∶3∶2∶0.2）]、展开系统Ⅵ[V甲醇∶V冰乙酸∶V水（13∶0.5∶7）]为展开剂，展开剂临用时配置。

ⅲ. Thin-Layer Chromatography（TLC）检测　精密吸取供试样品4μL点于0.5%CMC的硅胶G薄层板上，以展开系统Ⅰ、展开系统Ⅱ、展开系统Ⅲ、展开系统Ⅳ、展开系统Ⅴ、展开系统Ⅵ作为展开剂，展开约10cm，取出、晾干，紫外分析仪（254）或碘熏蒸检测，记录显色荧光点的颜色，并计算Rf值。

碘熏蒸法　将层析好的样板放入一加碘的密闭容器中，置于37℃烘箱内2～3min，然后取出，将熏制好的板放在酒精灯上小心烘烤，直至板上的显色点清晰可辨。

5.1.2　结果与分析

（1）最大吸收光谱波长的选择

扫描结果表明对照品溶剂和醇溶样品溶剂水溶样品溶剂均在210nm波长处有最大吸收值，210nm作为红茂草生物碱的含量测定的测定波长。

（2）红茂草提取液生物碱含量测定

根据测得标准试剂浓度梯度OD210值（0.229、0.466、0.687、0.943、1.172、1.385、1.575），绘制标准曲线，如图5-1所示。

经回归分析得到回归方程：Y=-0.00546+0.43956X，R=0.9999（n=7）

实验表明红茂草生物碱在0.1～0.7mg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系。

精密吸取红茂草6批醇溶、水溶提取液各100μL，稀释至10mL，测其OD210值。根据回归方程计算生物碱含量，由药渣质量计算其粗提率，结果如表5-1所示。

对醇溶与水溶提取液生物碱含量进行方差分析，结果如表5-2所示。

从表5-1得出醇溶提取生物碱平均为含量为3.33%，水溶提取生物碱平均含量为1.83%，前者比后者高1.5%。方差分析结果显示P<0.01，说明两提取方法差异性极显著，所以建议在工业化生产中使用醇溶法。

（3）红茂草中生物碱的分离

①Sephadex G-50柱层析分离

从Sephadex G-50柱层析被洗脱的醇溶样品（0.1mL）经波长254nm的紫外光谱分析，结果如图5-2所示。

从Sephadex G-50柱层析被洗脱的水溶样品（0.1mL）经波长254nm的紫外光谱分析，结果如图5-3所示。

从图5-2中看出，03、04号生物碱在254nm波长处有相近最大光吸收峰值，波峰面积最大，含量最多，其余3种含量均较少。

从图5-3中看出，04号生物碱在254nm波长处有最大光吸收峰值，波峰面积最大，含量最多，其余4种含量均较少。

Sephadex G-50常用于除去蛋白质等大分子物质中的盐分和其他小分子物质，这里只是初步分离。

②薄层层析分离

通过提取结果来看，红茂草生物碱主要是脂溶性，极性弱的，展开系统Ⅲ、展开系统Ⅳ、展开系统Ⅴ、展开系统Ⅵ分离效果均不佳。因此本实验采用展开系统Ⅰ和展开系统Ⅱ为展开剂。展开剂展开系统Ⅱ不如展开系统Ⅰ的分离效果好，它只能观察到4个荧光点，亮度较暗，Rf值相近且不易观察，且甲醇极性比乙醇大，对视神经有很强的毒害作用。同时，也对比得出醇溶提取液比水溶提取液的分离效果更好。结果如表5-3所示。

通过对不同的展开剂层析效果比较，得出展开剂的最佳配比为展开系统Ⅰ[V乙醇∶V冰乙酸∶V水（3∶0.1∶1）]，用醇溶提取液点样效果最好，通过紫外分析仪和碘熏蒸法可观察到5个颜色不同的荧光点，而水溶提取效果不佳。颜色从原点算起分别为：黄绿色、浅蓝色、橘黄色、蓝紫色、深绿色。经反复实验，测量计算得出它们的迁移率Rf值依次为：0.22，0.34，0.50，0.68，0.76。结果比较如图5-4～图5-6所示。

水溶提取液薄层层析碘熏蒸图与醇溶的效果相同。从显色效果来看，紫外检测与碘熏蒸法均较好。紫外检测可以立即观察到不同颜色的荧光点，但如果放置时间过长，荧光点会扩散消失；碘熏蒸法则适合于长期保存。这两种方法都适用于红茂草生物碱的检测与鉴定，建议同时使用。

5.1.3　结论

游离状态的生物碱根据溶解性能分为亲脂性生物碱和水溶性生物碱。亲脂性生物碱易溶于苯、乙醚、氯仿、卤代烷烃等极性低的有机溶剂，在丙酮、乙醇等亲水性有机溶剂中有较好的溶解度，而在水中溶解度较小或几乎不溶；水溶性生物碱易溶于水、酸水和碱水，在甲醇和正丁醇等极性大的有机溶剂中可溶解，但不溶于无极性或极性低的有机溶剂。红茂草中生物碱以亲脂性和亲水性两种状态存在，所以我们采用醇溶和水溶法两种方法提取生物碱。从醇溶和水溶提取液的分离结果来看，都分离到5种生物碱，结合粗提率与生物碱含量测定结果，证明醇溶法优于水溶法，适于在工业生产中的应用。

根据红茂草的提取与分离结果来看，用75%与85%的乙醇对其进行提取，其展开剂选用极性弱的展开系统Ⅰ为展开系统，分离效果好，斑点较圆整，形值适中。展开系统Ⅱ采用的展开剂，斑点虽能够分开，但不圆整，有扩散现象，形值较低，展开效果不及展开系统Ⅰ。故最终选用展开系统Ⅰ为红茂草薄层鉴别的展开剂。

薄层层析点样量要适宜，点样量多，荧光点之间就不易分开，相互间有拖带现象；点样量少，分辨率会提高，但成分偏少的点在图片上就不清晰，颜色也比较弱；图片本身是黑白的，距离较近的点之间又有斑点拖带现象，肉眼清晰可辨的点在图片上却不易区分，所以红茂草醇溶提取液的薄层层析紫外检测图谱中清晰可辨的点只有4个。不过，本实验所用的薄层层析展开剂是目前实验阶段分离鉴定红茂草生物碱的最好配比，为以后的探究提供一定的实验依据。

薄层层析法可以对所含的生物碱进行定量和定性分析，每种生物碱有其对应的Rf值和展开剂，而且在其含量少的情况下，不能用气相和高压液相色谱法进行测定，而薄层层析法就可将其有效灵敏分离其特别适用于分离很少量的物质。本实验采用薄层层析对红茂草中所含的生物碱进行分离，根据样品斑点面积可以估计该生物碱在红茂草中含量，通过每种生物碱透过紫外分析仪的颜色不同、Rf值不同对其进行定性分析。该方法定性鉴别，可节约溶剂和时间，样品处理量大，是一种廉价高效、简便快捷的分离方法。分离效果满意，专一性强，稳定性、重现性均好，可为质控定性鉴别提供依据。