4.4 红茂草种子萌发及组织培养最佳条件初探
4.4.1 材料与方法
（1）材料
①药材
采自人工种植和野生的一年或两年生红茂草，分别采集根、茎、叶柄和花苞部位。
②仪器与试剂
ZHJH-2112B超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）；生化培养箱；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；DDS-307A电导率仪（上海精科）。
琼脂（华美生物工程公司）；α-萘乙酸（NAA）（上海山浦化工有限公司）；6-苄基氨基嘌呤（6BA）（上海伯奥生物科技有限公司）；2，4-D（上海化学试剂总厂）；其他试剂均为国产分析纯试剂。
（2）方法
①红茂草种子萌发实验
选择当年收获的红茂草饱满种子100粒，将其浸泡48h。溶胀后，用无菌水冲洗4次，0.1%的赤霉素处理3min，再用无菌水冲洗5～6次，置于不同基质石英砂和蛭石中25℃进行种子萌发实验，每组重复四次。同样种子置于培养皿中25℃培养作为对照。
②红茂草愈伤组织的诱导
a.外植体的初次培养 将适中大小的叶片（花苞、花柄、茎、根），用自来水冲洗1～2min后，无菌水冲洗4～6次，70%的酒精处理20～30s，无菌水冲洗4次，0.1%的升汞处理5min，无菌水处理6次，后接种在MS培养基中，每瓶接种5个，于每天光照12h的生化培养箱中（24+1）℃培养。
b.外植体和培养基的选择 利用红茂草不同的外植体进行愈伤组织的诱导，出现的数量和质量有很大差异。相同的外植体在不同的培养基上培养，出现的状况亦不尽相同。本实验选用三种培养基，分别为MS、B5、SH，其中pH值控制在5.7～5.9，蔗糖浓度为2.5%，琼脂浓度为3.2‰～4‰。
c.激素的选择 植物愈伤组织的形成与激素的种类和浓度有很大的关系，选择适宜诱导红茂草愈伤组织形成的激素和最佳浓度是实验的关键。实验选用组织培养常用的激素2，4-D和6-BA+NAA，2，4-D浓度设定为0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L；6-BA+NAA浓度设定为（0.5+0.2）mg/L、（1.0+0.2）mg/L、（0.2+0.5）mg/L、（0.2+1.0）mg/L。每个实验组重复四次。
③红茂草愈伤组织的培养
培养温度为（25±2）℃，光照强度为50μmol/（m2·s），光照时间16h/d。在此条件下培养12d后，观察并统计各培养基中不同外植体的诱导情况。
采用SPSS 17.0软件对实验数据进行方差分析，以最小显著差数法（LSD）评价差异的显著性。
4.4.2 结果及分析
（1）红茂草种子萌发最佳基质
在不同的基质中，红茂草种子萌发的态势有很大差别，结果以百分率表示，见表4-7。对其进行方差分析，结果如表4-8所示。
表4-7 不同基质中红茂草种子萌芽率
表4-8 不同基质种子萌发率的单因素方差分析
由表4-9结果显示，三种基质对红茂草种子萌芽率的差异都达到极显著差异，其中，石英砂作为基质时，红茂草种子的萌发率最好，而蛭石作为基质时，萌发率最低。
表4-9 不同基质对种子萌发率的显著性比较（LSD法）
（2）红茂草愈伤组织诱导与培养
①不同外植体和培养基的选择
对红茂草不同外植体进行愈伤组织的诱导，在培养3～12d后，结果如表4-10及图4-6～图4-9所示。
表4-10 不同外植体愈伤组织的长势情况
图4-6 雌蕊愈伤组织
图4-7 两年生叶片愈伤组织
图4-8 褐化雌蕊愈伤组织
图4-9 褐化叶片愈伤组织
由图4-6～图4-9可以看出，选用红茂草的外植体诱导愈伤组织时，最好选择两年生的叶片或雌蕊来进行组织培养。
在几种培养基中，愈伤组织在MS培养基上的诱导率最高，其次是B5培养基，SH培养基上的诱导率最差，但MS培养基在其生长过程中有明显的褐化现象，而SH培养基未出现明显的褐化。综合愈伤组织诱导率及其生长状况，选用MS培养基作为诱导红茂草愈伤组织形成的培养基，B5培养基可作为继代培养的培养基。
②不同激素与不同浓度的选择
植物激素的种类，浓度与比例对诱导植物器官分化起着很重要的调节作用，利用两组激素组合2，4-D和6-BA+NAA对红茂草进行愈伤组织的诱导，结果见表4-11。对其进行方差分析，结果见表4-12。
表4-11 不同激素不同浓度愈伤组织统计
表4-12 不同激素不同浓度愈伤组织方差分析
方差分析结果显示，F>0.01，P<0.01，表明不同浓度的不同激素之间有极显著的差异，对此差异进行多重比较，如表4-13所示。
表4-13 不同激素不同浓度对愈伤组织的显著性比较（LSD法）
注：不同字母表示不同显著性差异程度。
由多重比较可知，2，4-D 1.0与2，4-D 3.0mg/L和6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L之间的差异达到极显著的程度，与2，4-D 0.5mg/L，2，4-D 2.0mg/L，6-BA 0.2mg/L+NAA 1.0mg/L之间达到显著差异。实验中，2，4-D 1.0mg/L实验组形成愈伤组织所用时间较其他组短。故考虑综合因素，在诱导红茂草形成愈伤组织时，利用激素2，4-D浓度为1.0mg/L的效果最好。
4.4.3 结论
从罂粟科植物中提取生物碱等有效成分在医学上已受到广泛关注，而罂粟科植物中红茂草的药用价值也已经得到了很好的验证。目前红茂草作为药材仍处于采集野生资源的状态，极不利于大规模开发利用，而且对生态环境破坏较大。
本实验结果表明，在室内人工控制条件下，红茂草种子在石英砂基质中萌发效果好，雌蕊和两年生的叶片是诱导愈伤组织形成的最佳外植体，选用红茂草花苞和两年生的叶片诱导形成愈伤组织，培养基MS+2，4-D（1.0mg/L）是最适合红茂草愈伤组织的培养条件。在此条件下，诱导率最高，可达80%，且培养效果最好。红茂草作为药用种苗，通过植物组织或器官的离体培养和形态发生，可实现药用种苗的大量快速繁殖。为保证红茂草作为药材的质量和产量，以植物激素诱导红茂草产生愈伤组织，为大规模产业化生产实践提供相关理论基础。