2.2 实验材料与方法

2.2.1 实验材料

1．分离材料

玉米大、小斑病新病叶，苹果炭疽病染病果实，棉花枯萎病染病茎秆，甘薯软腐病染病块茎等。

2．实验材料

PDA培养基、无菌培养皿及吸管、试管架、25%乳酸、10%漂白粉溶液（随配随用）、解剖刀、剪刀、0.1%升汞液、70%和95%乙醇溶液、灭菌水、纱布、蜡笔等。

3．马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）的配制

马铃薯200g、葡萄糖10～20g、琼脂17～20g、水1000mL。具体方法是将去皮马铃薯切碎，加水1000mL，煮沸半小时，用纱布滤去马铃薯，加水补足1000mL，然后加糖和琼脂，加热使琼脂完全熔化，再用纱布过滤一次即可分装灭菌。

4.1%升汞液的配制

升汞1g，浓盐酸2.5mL，水1000mL。先将升汞溶于浓盐酸中，然后加水稀释。

2.2.2 实验方法

1．灭菌

灭菌的方法很多，利用高温杀菌是最重要的灭菌法。

（1）湿热灭菌

将分装好的培养基或其他需灭菌的器具放入高压蒸汽灭菌锅中，加盖后加热，放气使锅内的空气排出，然后在121℃下灭菌20min即可。

注意：灭菌锅中的水量应在指定的标度；打开放气阀门加热，待空气完全排除后关闭阀门；当压力达到所需要的指标后，开始计算灭菌时间，并保持压力不变；停止加热，等压力降低到内外相等时，才能打开灭菌锅盖。

（2）干热灭菌

将要灭菌的器物如培养皿、试管等放在电热干燥箱中，加热使温度保持在160～165℃，灭菌1h即可。

2．工作环境的清洁和消毒

为了达到预期目的，分离和培养工作必须在很清洁的环境下以无菌操作法进行，一般可在无菌室或无菌箱中进行。无菌室或无菌箱要经过喷雾除尘，并用药剂或紫外线消毒。经过喷雾除去空气及地面的灰尘后进行无菌操作也可获得较理想的结果。在工作前，桌面应擦洗干净，铺上湿的纱布，将分离所需要的全部材料放在工作台上。同时应注意在工作的房间要关闭门窗，尽量避免人员走动，工作人员要保持清洁。

3．用具的准备和消毒

在分离时凡是与分离材料接触的用具，都要随时消毒，保持无菌，如移植针、剪刀等可浸在95%乙醇溶液中消毒，用时在火焰上烧去乙醇溶液，如此2～3次，再次使用时必须重新灭菌。培养皿和试管等都需经过干热灭菌，培养基和蒸馏水等都需要经过湿热高压灭菌。

4．分离材料的选择

分离材料的选择对分离培养的结果有决定性的影响，因为任何感病植物坏死部分的表面及内部，都可能有腐生微生物的滋生。所以在分离时应选择新感病的组织，切勿取老病斑的中央部分，最好是取病健交界处的组织作为分离材料，这样可以减少腐生微生物的污染，同时病原物也处于较为活跃的状态，容易获得所要分离的病原菌。

2.2.3 植物病原真菌的分离步骤

根据病原生物及植物病组织的不同，可采用不同的分离方法。

1．叶斑病类型分离

（1）取灭菌培养皿两副，在培养基上注明分离日期、材料等。为减少细菌的污染，在皿内滴25%乳酸2～3滴（也可在培养基中加入少量抗生素如链霉素）。如果能注意无菌操作，并不一定要加入乳酸，对有些真菌的分离（如藻菌）加入乳酸甚至不利于病菌的生长。

（2）倾倒培养基平板。在无菌操作的条件下将熔化的PDA培养基倒入培养皿（试管或三角烧瓶）内，轻轻摇动，冷却后即成平板。

（3）取玉米大、小斑病病叶，经自来水冲洗，选择典型的单独病斑连同周围1～2 mm范围的健康组织剪下数小块（3～5mm2）。先在70%乙醇溶液中浸数秒后，移入0.1%升汞液中消毒40～60s。消毒时间的长短视病组织小块的大小、厚薄而定，组织薄、小时消毒时间可短些，到时间后立即将升汞倒去，并迅速用灭菌水冲洗3～4次，或用10%漂白粉溶液消毒5 min，并用灭菌水冲洗2～3次。

（4）用经过火焰3次灭菌的镊子将上述病叶小块移入培养皿中，每副培养皿可均匀放入4～5块，使病叶与培养基紧密接触，然后将培养皿翻转放在25～26℃的恒温箱内培养。

（5）培养3～4d后，在病组织周围长出菌丝体，形成菌落。挑选典型而附近无杂菌的菌落，在其边缘用接种针挑取带有菌丝尖端的培养基一小块，移入试管中斜面培养基的中央（必要时可先在平板培养基上纯化几次），置于25～26℃的恒温箱内培养数日，获得纯菌种，镜检并在冰箱中保存菌种。

2．深层组织内病原真菌的分离（如果实、块茎等）

（1）培养基制备如上所述。

（2）选发生苹果炭疽病的果实（或甘薯软腐病的块茎），用70%乙醇溶液擦洗果皮表面，用火焰烧去多余的乙醇溶液，重复2～3次进行表面消毒。

（3）用灭菌的解剖刀将皮翘起，在病健交界处取小块变色的带菌组织，直接移入培养皿的培养基平板上，排列均匀，置于25～26℃的恒温箱内培养。

3．维管束病原真菌的分离

取棉花枯萎病茎秆，先将组织表面消毒，用灭菌的解剖刀剥去表面，然后切取中央小块变色的维管束组织，移植于培养基平板上培养。消毒方法视材料而定，可先在70%乙醇溶液中浸数秒，再用0.1%升汞液消毒，最后用无菌水冲洗数次。培养方法同上。

4．种子病原真菌的分离

将整粒种子或种子的一部分用0.1%升汞液或10%漂白粉溶液消毒，用灭菌水洗涤后移至培养基上培养。对有些较大的种子也可将其浸入95%乙醇溶液中，然后烧去乙醇溶液进行表面消毒。培养方法同上。

2.2.4 分离物的纯化步骤

为了满足进一步研究的需要，上述获得的分离物必须经过纯化，才能成为纯培养。纯化方法有单细胞分离法和连续稀释培养法，其中后者较为简便而常用。

真菌的连续稀释培养纯化法就是切取典型菌落边缘含菌丝的培养基小块，移植至平板培养基上，待其形成菌落后，再次在它的边缘切取培养，如此连续进行数次，即可移入斜面培养基试管中培养保存。