1.2 植物组织培养技术发展简史

1.2.1 早期的奠基工作

细胞学说创始人Schwann（1839）指出只要提供与机体内相同的外界条件，多细胞有机体的每一个生活细胞都能够独立生存和发展[1]。1901年，Morgan最初提出全能细胞的概念：能够通过再生作用发育成完整有机体的细胞是全能细胞（totipotent cell）[2]。这种全能细胞概念激励科学家进行组织培养探索。

Haberlandt[3]明确提出植物细胞全能性概念：任何生活的植物细胞都可以培养形成完整植株，并在人工合成的培养基上尝试培养叶肉细胞，他培养的细胞不能分裂，未获成功。Hannig[4]将萝卜和辣根菜（Cochlearia officinalis）未完全成熟的胚胎培养于含有糖、无机盐、氨基酸和植物提取物的培养基中，发现离体胚可以充分发育。Haberlandt的学生Kotté[5][6]与美国的Ro-brins[7][8]开始做根尖培养，未获成功。

Dieterich[9]记载了成熟胚在含无机盐和2.5%～5%蔗糖的半固体培养基上能正常生长。但未成熟胚不能生长成熟，它们直接生长成为幼苗，作者称之为胚的早熟萌发（precocious ger-mination）。Laibach[10]将胚胎培养用于杂交不孕的胚胎挽救。

White[11]用番茄根尖建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，28年间培养了1600代。其后他发现B族维生素对离体根持续生长的作用，并认识到吲哚乙酸（IAA）调控植物生长的作用，建立了植物组织培养的合成培养基[11～13]，植物组织培养超越了动物组织培养（动物培养总离不开天然产物，如血清、肉冻等）。李继侗[14][15]培养银杏胚胎成功，并用以研究胚胎后熟作用。罗宗洛和罗士韦于1935年将禾谷类植物根尖长期继代培养成功[16]。

Gautheret（法国细胞学家Guillarmond的学生）进行了山柳、黑杨形成层培养[17]。

Gautheret[18～21], Nobécourt[22][23]和White[13]等差不多同时从烟草茎段和胡萝卜根的形成层细胞得到能长期培养的愈伤组织。White出版了专著A Handbook of Plant Tissue Culture[24]，使植物组织培养成为一门新兴的学科。

1.2.2 器官发生激素调控的发现

Skoog和崔澂[25]在烟草茎段和髓培养及器官形成的研究中发现，腺嘌呤或核苷可解除培养基中IAA对芽形成的抑制作用，腺嘌呤与生长素的比例可调控芽和根的形成。Miller等[26]发现了激动素（kinetin），它可替代腺嘌呤促进芽的形成，且其效果约增加3万倍。这些成果推动了植物组织培养的发展。

1.2.3 20世纪50～60年代的进展

植物组织培养技术的改进、生长调节物质的发现和作用机理的深入研究，促进了组织培养的进一步发展。Nitsch[27][28]对离体果实的培养促进了果实、子房、胚珠及花器官各部位培养的研究。Muir[29][30]以及Steward和Reinert等分别于1953年和1956年在液体培养基中振荡培养或旋转培养愈伤组织，得到了细胞群；其后，Reinert发现了液体培养基中单细胞的分裂，并继续向着形成胚或一定形态的方向发展。Steward[31][32]和Reinert[33]分别从胡萝卜根愈伤组织培养中得到再生植株，第一次用实验证实了植物细胞的全能性。Steward使用液体旋转培养，细胞再生频率高，影响较大；Reinert用的是固体培养，再生频率较低。法国Morel[34]用组织培养技术快速繁殖兰花，将此技术用于大规模生产。印度Kanta等[35]取出罂粟未受精胚珠（带有小块胎座组织），置于离体条件下授粉，实现了试管受精。Guha和Maheshwari[36][37]在毛叶曼陀罗花药培养中，成功地诱导出花粉单倍体植株，证明了小孢子也具有全能性，掀起了单倍体育种高潮。Cocking[38]用酶解法大量分离出烟草叶肉原生质体，培养成再生植株，由此发展成细胞融合技术，为高等植物生物工程奠定了一部分技术基础。

1.2.4 20世纪下半叶至今

1973年Tran Thanh Van通过烟草薄层培养，观察到从开花植株的不同部位分离的外植体产生的再生植株在分化花芽时表现出明显的规律性：从基部分离的外植体要生长很长的时间才分化花芽；从植株中部分离的外植体衍生的再生植株营养生长时间较短，较快地形成花芽；从植株上部的外植体产生的再生植株的营养生长时间最短；从花序分支上分离的外植体则直接分化花芽。这种现象称为“成花的梯度效应”。这一发现虽然没有阐明成花梯度的机理，但在某一方面增加了组织培养的预见性。

中国科学院植物研究所陆文樑及其合作者从80年代开始对植物器官再生进行了长期、系统的探索和研究。他们用风信子（Hyacinthus orientalis）、小麦（Triticum aestivum）、水仙（Narcis-sus tazetta）、番红花（Crocus sativus）、郁金香（Tunipa gesneriana）、番茄（Lycopersicon esculentum）和花叶千年木（Dracaena fragranx cv.massangeana）等植物为材料，对根、营养芽、花序、花序分支、花芽、花被、雄蕊、雌蕊、花柱和柱头、胚珠和果实等被子植物的几乎所有的器官实现了离体再生，称之为“器官克隆”。他们准确地掌握了克隆每一种器官所需要的条件，发现分离外植体的器官在供体植株个体发育中分化的时期和外源生长素的浓度两个因素，以及这两个因素对外植体可以再生多少种器官以及再生何种器官的规律性，并据此提出“细胞全能性的部分表达”假说、“细胞的发育和逆发育”以及“生长素浓度在离体器官按次序发生中的变化起着转换开关的作用”的假说用来解释这种规律性（详见1.3.4小节）。

这一时期分子生物学向各学科加速渗透，植物组织培养研究进一步深入，与遗传转化和探讨基因表达相结合。这种趋势一方面表现在与日俱增地采用分子生物学的分析测试技术，另一方面应用分子生物学观点剖析和研究组织培养中遇到的问题。当今植物组织培养已经成为迅速发展的植物生物技术的主要手段之一。