第二章 生物科技实验
实验一 CTAB法提取植物DNA
实验目的
(1)掌握CTAB法提取植物DNA的原理和方法。
(2)采用CTAB法从植物叶片中提取DNA。
实验原理
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromid,十六烷基三甲基溴化铵)法是提取植物DNA的经典方法。CTAB是一种阳离子去污剂,可以溶解细胞膜,将膜内核蛋白释放;同时,CTAB具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
在DNA提取、制备的过程中,核酸极不稳定,许多因素可破坏其完整结构:①化学因素,核酸的结构在pH值4.0~11.0间较稳定,pH值在此范围外就会使核酸变性降解,故制备过程应避免过酸、过碱。②物理因素,DNA分子链很长,是双螺旋结构,既有一定的柔性又有一定的刚性,故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂,不利于收集,应加以避免。③酶的作用,细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来,它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸钠盐(ETDA-Na2)等。SDS和苯酚作为蛋白变性剂,同时可使核酸酶被破坏而失活。
注:CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出,因此,在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。
试剂与仪器
1.试剂与溶液
(1)2×CTAB提取缓冲液
2×CTAB提取缓冲液中各试剂的作用如下。
①Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏。
②EDTA可以螯合Mg2+或Mn2+,抑制DNase活性。
③NaCl提供一个高盐环境,使DNA核蛋白充分溶解。
④CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离。
⑤β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除。
(2)TE缓冲液 10mmol/L Tris-HCl(pH 7.4),1mmol/L EDTA,高压灭菌,室温保存。
(3)氯仿-异戊醇(24:1)。
(4)液氮。
(5)70%乙醇和无水乙醇、双蒸水。
2.仪器设备
研钵、恒温水浴锅、冷冻离心机、移液器、移液管、1.5mL离心管、冰箱、培养箱。
实验步骤
(1)取两片幼嫩新鲜叶片,70%乙醇清洗,双蒸水冲洗干净后,置于预冷的研钵中,倒入适量液氮,迅速研磨成粉末状,随后加入3mL预热的含有β-巯基乙醇的2×CTAB提取缓冲液,继续研磨成略有流动性的糊状或粥状,转入1.5mL的离心管中,于65℃水浴锅中保温约60min(期间定时上下翻转5~10次)。
(2)待混合物冷却至室温后加入等600μL的氯仿-异戊醇溶液混匀,轻轻颠倒离心管几次,使管内混合物成乳浊液,常温下10000r/min离心10min,取上清液转入另一干净的离心管中。
(3)重复步骤(2)一次。
(4)取步骤(3)上清液加入2.5倍体积无水乙醇,仔细混匀,-20℃冰箱30min以上,沉淀DNA 4℃ 12000r/min离心10min。
(5)弃去上层有机溶剂,加500μL 70%乙醇洗涤沉淀,4℃ 8000r/min离心5min,弃去上清液,洗涤沉淀3次。
(6)倒置或者37℃培养箱烘干。
(7)加50μL TE缓冲液溶解DNA,于-20℃冷藏备用。
思考题
在DNA提取过程中为什么动作要轻柔?