第四节　应用与实例

一、定性分析与实例

1.与对照品比较吸收光谱曲线的一致性

在相同的测量条件下，分别测定未知物和对照品的吸收光谱曲线，对照和比较二者是否一致。当没有对照品时，也可以与该化合物的对照图谱直接比较。

如果两个化合物的结构相同，在相同条件下，两个吸收光谱曲线应完全相同，曲线应能完全重叠，再比较两个化合物的最大吸收波长、最小吸收波长、吸收峰的数目、吸收峰的位置和强度（吸收系数）、吸光度的比值在规定范围内等光谱特征，也应完全一致，才可以初步判断是同一化合物。例如，阿替洛尔的鉴别第一项，《中国药典》2015年版（二部）规定，本品10μg/mL无水乙醇溶液在227nm、276nm和283nm波长处有最大吸收。

如果两个化合物的吸收光谱曲线的形状和光谱特征有差异，则可以肯定认为二者不是同一种化合物。例如，醋酸可的松、醋酸氢化可的松和醋酸泼尼松三种药品的最大吸收波长（240nm）、摩尔吸收系数［1.5×104L/（mol·cm）］和百分吸收系数［390mL/（g·cm）］几乎完全相同，但它们的吸收光谱曲线依然存在某些差别。

特别要注意，吸收光谱曲线完全相同的物质不一定是同一物质。因为吸收光谱曲线是有机物的官能团对紫外光的选择性吸收而产生的，不是整个分子或离子的特征，主要官能团相同的物质可以产生非常相似、甚至雷同的吸收光谱曲线。所以必须得到其他光谱方法或仪器分析方法进一步证实后，才能得出较为肯定的结论。

2.比较吸收光谱曲线的特征数据

最大吸收波长和吸收系数，是用于定性鉴别的主要光谱特征数据。在不同化合物的吸收光谱中，最大吸收波长可以相同，但因相对分子质量不同，吸收系数的数值会有差别。有些化合物的吸收峰较多，而各吸收峰对应的吸光度或吸收系数的比值是一定的，也可以作为定性鉴别的依据。因此，不同的最大吸收波长处的吸光度的比值是用于鉴别化合物的特性常数之一。

《中国药典》2015年版（二部）对某些药物的定性鉴别作了相应的规定。如贝诺酯的性状检查第三项（吸收系数），本品加无水乙醇制成1mL约含7.5μg的溶液，它的吸收光谱曲线在240nm处有最大吸收，相应的百分吸收系数应为730～760mL/（g·cm）；硝西泮的鉴别第二项，它的吸收光谱曲线有三个吸收峰，分别在220nm、260nm和310nm波长处有最大吸收，260nm与310nm波长处的吸光度的比值应为1.45～1.65；维生素B12的鉴别第二项，它的吸收光谱曲线也有三个吸收峰，分别在278nm、361nm和550nm波长处有最大吸收，它们的吸光度比值应为A361nm/A278nm在1.70～1.88，A361nm/A550nm在3.15～3.45。

目前，已有多种以实验结果为基础的有机化合物的紫外-可见标准谱图以及中国药典中收录的各种药物的对照谱图，均可以作为药物定性鉴别的依据。

二、纯度检查与实例

利用杂质与药物在紫外-可见光区的吸收差异，选择适当波长进行测定，可以检查药物的纯度，具体方法如下。

1.杂质检查

有些杂质药品中不允许存在，如果杂质在药品无吸收的紫外-可见光区有吸收，或药品在杂质吸收峰处无吸收，则杂质很容易被检查出来。例如，检查乙醇中苯等杂质，乙醇在紫外-可见光区无吸收，无吸收光谱曲线。而杂质苯在紫外-可见光区有吸收，有吸收光谱曲线，在256nm处有苯的特征吸收，乙醇中含苯量低达0.001％也能检出。《中国药典》2015年版（二部）规定，取本品，以水为空白测定吸光度，在240nm的波长处不得过0.08；250～260nm的波长范围内不得过0.06；270～340nm的波长范围内不得过0.02。

2.杂质限量检查

（1）以某个波长的吸光度值表示　当杂质在某一波长处有最大吸收，而药物在该波长处无吸收时，可以通过测定供试品溶液在该波长处的吸光度检查杂质限量。例如，肾上腺素中肾上腺酮的杂质限量检查。由于肾上腺素和肾上腺酮在0.5mol/L HCl溶液的紫外吸收光谱曲线有显著不同，肾上腺酮在310nm处有最大吸收，而肾上腺素在该波长处几乎无吸收。因此，限定肾上腺素在0.5mol/L HCl溶液的吸光度，即可控制肾上腺酮的杂质限量。《中国药典》2015年版（二部）规定，将肾上腺素用0.5mol/L HCl溶液制成2.0mg/mL溶液，在1cm吸收池中，于310nm处测定吸光度，吸光度不得过0.05。若以肾上腺酮在310nm处的计算，则肾上腺酮的限量为0.06％。

课堂互动

肾上腺素用0.5mol/L HCl溶液制成2.0mg/mL溶液，在1cm吸收池中，于310nm处测定吸光度，吸光度不得过0.05。为什么以肾上腺酮在310nm处的=453计算，则肾上腺酮的限量为0.06％？

（2）以峰谷吸光度的比值表示　某些杂质与药物的紫外吸收光谱曲线重叠，可以通过测定供试品溶液的吸光度比值检查杂质限量。例如，苯丙醇中苯丙酮的杂质限量检查。由于苯丙醇和苯丙酮在乙醇中的紫外吸收光谱曲线严重重叠，因此，通过测定供试品溶液在某波长处的吸光度检查杂质限量显然不可能。但是，在苯丙醇纯品中加入不同量的苯丙酮纯品时，发现A247nm/A258nm之比与苯丙酮含量呈线性关系，苯丙醇纯品在A247nm/A258nm之比为0.59，当苯丙醇中含苯丙酮为0.5％时，A247nm/A258nm之比为0.79。《中国药典》2015年版（二部）规定，取本品，加乙醇制成1mL中含0.5mg的溶液，在247nm和258nm测吸光度，A247nm/A258nm之比不得过0.79。

三、定量分析与实例

根据光的吸收定律，可以选择适当波长的光作为入射光，通过测定溶液的吸光度进行定量分析。对于在紫外-可见光区有吸收的物质，可直接进行定量测定；对于在紫外-可见光区无吸收的物质，可以在溶液中加入适当的显色剂，使之生成在紫外-可见光区有吸收的物质，实现定量测定。常用的定量方法如下。

1.单组分溶液分析

（1）标准曲线法　标准曲线法是紫外-可见分光光度法中最经典的定量方法，特别适合于大批量样品的定量测定。具体测定的方法和步骤如下。

①配制一系列不同浓度的标准溶液，用不含待测组分的空白溶液作为参比，在相同的条件下，以待测组分的最大吸收波长（λmax）作为入射光，分别测定各标准溶液对应的吸光度。

②以溶液浓度（c）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。根据光的吸收定律可知，如果标准系列的浓度适当、测定条件合适，标准曲线是一条通过原点的直线，如图4-3所示。

③按照相同的实验条件和操作程序，用待测物质溶液稀释后配制成供试品溶液并测定其吸光度（A样），在标准曲线上找到与之对应的供试品溶液的浓度（c样），则待测物质溶液的浓度c原样为：

c原样=c样×稀释倍数　　（4-13）

由此可见，测定大批量样品时，只重复最后一步操作，即可完成工作任务。

（2）吸收系数法　吸收系数法又称绝对法，是直接利用光的吸收定律进行计算的定量分析方法。在有关资料中查出待测物质在最大吸收波长（λmax）处的吸收系数ε或，并在相同条件下测量供试品溶液的吸光度（A），根据光的吸收定律计算待测溶液的浓度，即：

【例4-3】维生素B12注射液，在λmax=361nm处的=207mL/（g·cm）。若用1cm厚度的吸收池，测得供试品溶液的吸光度为0.621，求该溶液的浓度。

解：

答：该维生素B12注射液的浓度为3.00×10-5g/mL。

《中国药典》2015年版（二部）规定，精密量取本品适量，加水定量稀释成1mL中约含维生素B1225μg的溶液，在361nm波长处测定吸光度，按C63H88CoN14O14P的百分吸收系数（）为207计算，含维生素B12（C63H88CoN14O14P）应为标示量的90.0％～110.0％。

注意，应用本法测定，百分吸收系数（）通常应大于100。

（3）对照品比较法（或标准对照法）　在相同的条件下，配制浓度为cs的对照品溶液（或标准溶液）和浓度为cx的供试品溶液，在最大吸收波长（λmax）处，分别测定二者的吸光度值为As、Ax，依据光的吸收定律得：

As=kcsL　　（4-15）

Ax=kcxL　　（4-16）

因为对照品溶液与供试品溶液中的吸光性物质是同一化合物，所以，在相同的条件下，液层厚度L和吸收系数k的数值相等，由式（4-15）和式（4-16）得

【例4-4】有一浓度为6.00μg/mL的Fe3+对照品溶液，在480nm处测得其吸光度为0.304，在同一条件下测得供试品溶液吸光度为0.510，求试样溶液中Fe3+的含量。

解：

答：供试品溶液中Fe3+的含量为10.1μg/mL。

2.多组分溶液分析

当试样溶液中存在多种吸光性组分时，溶液的吸光度具有加和性，以此可以对多组分溶液进行定量分析。下面以含有两个吸光性组分a和b的溶液为例说明之。

当试样溶液中各待测组分相互干扰不太严重时，如果分别绘制待测组分a和b的纯物质的吸收光谱曲线，则有下列三种情况，如图4-14所示。

图4-14（a）表明，两个待测组分彼此几乎不干扰，即在待测组分各自的最大吸收波长处进行测定，而另一个待测组分无吸收，这种情况可以用单组分的定量分析方法，在λ1波长处测定组分a，在λ2波长处测定组分b，测定时，彼此不产生干扰。

图4-14（b）表明，在待测组分a的最大吸收波长λ1处，组分b无吸收，而在待测组分b的最大吸收波长λ2处，组分a有吸收，即待测组分b对待测组分a的测定无干扰，待测组分a对待测组分b的测定有干扰。这种情况可以先用单组分的定量分析方法，在波长λ1处测定组分a，然后在波长λ2处测量溶液的总吸光度及a、b纯物质的和值，根据吸光度的加和性，则

在式（4-19）中，ca、、和已经测得，当用1cm的比色皿进行测定时，即可以求算出cb。

图4-14（c）表明，两个待测组分彼此相互干扰，此时有几种测定方法。

（1）解联立方程组法　在波长λ1和λ2处分别测定试样溶液的总吸光度及，同时测定a、b纯物质的、及、，根据朗伯-比尔定律和吸光度的加和性，则

当用1cm的比色皿进行测定时，联立式（4-20）和式（4-21）方程组，即可求算出ca和cb。

很显然，如果溶液中有n个待测组分，且光谱互相有干扰，就必须在n个波长处分别测定试样溶液的总吸光度（吸光度加和值），以及各波长处n个纯物质的摩尔吸收系数，然后解n元一次方程组，进而求出各待测组分的浓度。但是，在实际测定时，试样中待测组分越多、彼此干扰越严重，测定结果的误差就越大。

（2）双波长分光光度法　当试样中两个待测组分的相互干扰比较严重时，用解联立方程组的方法进行定量分析会产生较大的误差，这时可以用双波长分光光度法进行测定，主要有以下两种方法。

①等吸收波长消去法　试样中的两个待测组分a和b相互干扰比较严重时，若要测定试样中的待测组分b，则应设法消除组分a的吸收干扰。

首先，分别绘制待测组分a和b的纯物质的吸收光谱曲线，选择待测组分b的最大吸收波长λ2作为测量波长，测定试样溶液的吸光度，然后用作图的方法选择参比波长λ1，使组分a在这两个波长处的吸光度相等，即，且使待测组分b在λ2和λ1这两个波长处的吸光度有尽可能大的差别，以λ1作为测量波长，测定试样溶液的吸光度，如图4-15（a）所示。

根据吸光度的加和性，试样溶液在λ2和λ1波长处的吸光度分别为：

因为，所以，根据朗伯-比尔定律可得：

式（4-24）表明，试样溶液在λ2和λ1波长处的吸光度之差ΔA与待测组分b的浓度成正比，而与组分a的浓度无关，即消除了组分a的干扰，可以根据ΔA求得待测组分b的浓度。

用双波长分光光度计测定时，输出信号是ΔA，计算很方便。

同理，若要测定组分a，而组分b有干扰时，如图4-15（b）所示，可用上述同样的方法求得待测组分a的浓度。

用等吸收波长消去法测定时，干扰组分的吸收光谱至少应有一个吸收峰或谷，才有可能找到干扰组分吸收度相等的两个波长。否则，无法用这种方法进行定量测定。

②系数倍率法（倍率减差法）　当干扰组分a的吸收光谱曲线没有吸收峰或谷，仅是陡坡状时，无法找到组分a的吸光度相等的两个波长，如图4-16所示。在这种情况下，可采用系数倍率法测定待测组分b的浓度。

具体做法是：选择两个波长λ1、λ2，分别测定试样溶液的总吸光度和，由于组分a在λ2波长处的吸光度小于该组分在λ1波长处的吸光度，故令（称为掩蔽系数），利用双波长分光光度计中差分函数放大器，把放大K倍，则：

根据朗伯-比尔定律和式（4-25）～式（4-27）得：

可见，ΔA与干扰组分a的浓度无关，而只与待测组分b的浓度cb成正比，即消除了组分a的干扰。双波长分光光度计的输出信号为ΔA，很容易求得待测组分的浓度，故系数倍率法已经在药物分析中得到了较为广泛的应用。

将放大K（掩蔽系数）倍时，干扰组分和待测组分吸光度同时也被放大了K倍，使测得的ΔA值增大，从而提高了灵敏度。但是，K值过大时，噪声被放大，故控制适宜的K值一般应在5～7为宜。

（马纪伟）

习题

一、填空题

1.朗伯定律是指在一定条件下，溶液的吸光度与_______成正比；比尔定律是指在一定条件下，溶液的吸光度与_______成正比，二者合为一体称为朗伯-比尔定律，其数学表达式为_______。

2.摩尔吸收系数的单位是_______，它表示物质的浓度为_______，液层厚度为_______时，在一定波长下溶液的吸光度，常用符号_______表示。

3.紫外-可见分光光度计，可见光区使用的光源是_______灯，用的棱镜和比色皿的材质可以是______；而在紫外光区使用的光源是_______或_______灯，用的棱镜和比色皿的材质一定是_______。

4.影响有色配合物的摩尔吸收系数的因素是_______。

5.二苯硫腙的CCl4溶液吸收560～620nm范围内的光，溶液呈_______色。

6.已知某有色配合物在一定波长下用2cm吸收池测定时其透光度T=0.50。若在相同条件下，改用1cm吸收池测定，吸光度A为_______，用3cm吸收池测量，T为_______。

7.紫外-可见吸收光谱，以_______为横坐标，以_______为纵坐标绘制的曲线，吸收曲线上最大吸收峰所对应的波长为_______，用_______表示。

8.用紫外-可见分光光度法测定样品含量，常用的方法有_______、_______和_______。

二、单项选择题

1.紫外-可见分光光度法的缩写符号是（　）。

A.UV-VIS

B.IR

C.HPLC

D.GC

E.NMR

2.物质的颜色是由于选择吸收了白光中的某些波长的光所致。CuSO4溶液呈蓝色是由于它吸收了白光中的（　）。

A.蓝色光波

B.绿色光波

C.黄色光波

D.紫色光波

E.红色光波

3.对符合光的吸收定律的溶液稀释时，其最大吸收峰波长位置（　）。

A.向长波移动

B.向短波移动

C.不移动，吸收峰值升高

D.不移动，吸收峰值降低

E.无法判断

4.当吸光度A=0时，T为（　）。

A.0

B.10％

C.100％

D.∞

E.1

5.某有色溶液浓度为c，测得透光率为T，将浓度稀释到原来的一半，在同样条件下测得的透光率应为（　）。

A.T

B.2T

C.T/2

D.T2

E.

6.在符合朗伯-比尔定律的范围内，有色物的浓度、最大吸收波长、吸光度三者的关系是（　）。

A.增加，增加，增加

B.减小，不变，减小

C.减小，增加，增加

D.增加，不变，减小

E.增加，减小，增加

7.某吸光物质（M=180）的ε=6×103L/（mol·cm），则百分吸收系数为（　）。

A.33.3mL/（g·cm）

B.333.3mL/（g·cm）

C.1.08×106mL/（g·cm）

D.1.08×103mL/（g·cm）

E.1.08mL/（g·cm）

8.下列说法正确的是（　）。

A.吸收曲线与物质的性质无关

B.吸收曲线的基本形状与溶液浓度无关

C.浓度越大，吸收系数越大

D.在其他因素一定时，吸光度与测定波长成正比

E.吸收曲线是一条通过原点的直线

9.紫外-可见分光光度分析法误差的主要来源是（　）。

A.标准溶液浓度不准确

B.存在干扰物质

C.显色剂过量

D.单色光不纯

E.读数不准确

10.钨灯或卤钨灯发射的光，波长范围是（　）。

A.760～1000nm

B.360～800nm

C.400～760nm

D.400nm以下

E.350～1000nm

11.紫外-可见光的波长范围是（　）。

A.200～400nm

B.400～760nm

C.200～760nm

D.360～800nm

E.小于200nm

12.某有色溶液的物质的量浓度为c，在一定条件下用1cm比色杯测得吸光度为A，则摩尔吸收系数为（　）。

A.cA

B.cM

C.A/c

D.c/A

E.c/M

13.某吸光物质的吸收系数很大，则表明（　）。

A.该物质溶液的浓度很大

B.测定该物质的灵敏度高

C.入射光的波长很大

D.该物质的相对分子质量很大

E.该物质的性质稳定

14.吸收曲线是在一定条件下以入射光波长为横坐标、吸光度为纵坐标所描绘的曲线，又称为（　）。

A.工作曲线

B.A-λ曲线

C.A-c曲线

D.滴定曲线

E.色谱图

15.标准曲线是在一定条件下以吸光度为横坐标、溶液浓度为纵坐标所描绘的曲线，也可称为（　）。

A.A-λ曲线

B.A-c曲线

C.滴定曲线

D.E-V曲线

E.色谱图

16.紫外-可见分光光度法定量分析的理论依据是（　）。

A.吸收曲线

B.吸收系数

C.光的吸收定律

D.能斯特方程

E.吸收光谱的特征数据

17.某种溶液的吸光度（　）。

A.与比色杯厚度成正比

B.与溶液的浓度成反比

C.与溶液体积成正比

D.与入射光的波长成正比

E.与入射光的强度成正比

18.相同条件下，测定甲、乙两份同一有色物质溶液的吸光度。若甲溶液以1cm吸收池，乙溶液以2cm吸收池进行测定，结果吸光度相同，甲、乙两溶液浓度的关系（　）。

A.c甲=c乙

B.c乙=4c甲

C.c乙=2c甲

D.c甲=2c乙

E.c甲=lgc乙

19.光的吸收定律通常适用于（　）。

A.散射光

B.复合光

C.单色光

D.折射光

E.浓溶液

三、简答题

1.紫外-可见分光光度法具有什么特点？

2.紫外-可见分光光度计由哪几个主要部件组成？各部件的作用是什么？

3.紫外-可见分光光度法测定物质含量时，当显色反应确定以后，应从哪几个方面选择实验条件？

4.测量吸光度时，应如何选择参比溶液？

5.什么是紫外-可见分光光度法中的吸收曲线？制作吸收曲线的目的是什么？

6.为什么最好在λmax处测定化合物的含量？

四、计算题

1.某试液用2.0cm的吸收池测量透光率时T=60％，若用1.0cm、3.0cm和4.0cm吸收池测定时，透光率各是多少？

2.K2CrO4的碱性溶液在372nm处有最大吸收，若其浓度c=3.00×10-5mol/L，吸收池厚度为1.0cm，在此波长下测得透光率为71.6％。试计算：（1）该溶液的吸光度；（2）摩尔吸收系数；（3）若吸收池厚度为3cm，则透光率为多大？

3.用安络血（相对分子质量为236）纯品配制100mL含安络血0.4300mg的溶液，以1.00cm厚的吸收池在λmax=355nm处测得其吸光度A值为0.483，试求安络血在355nm的和ε值。

4.有一标准Fe3+溶液，浓度为6μg/mL，其吸光度为0.304，而试样溶液在同一条件下测得吸光度为0.510，求试样溶液中Fe3+的含量（mg/L）。

5.称取维生素C0.05g溶于100mL的0.005mol/L硫酸溶液中，再准确量取此溶液2.00mL稀释至100mL，取此溶液于1cm吸收池中，在λmax245nm处测得A值为0.551，求试样中维生素C的含量［（245nm）=560］

6.某化合物的摩尔质量为125g/mol，摩尔吸收系数为2.5×105L/（mol·cm），配制该化合物溶液1L，将其稀释200倍，于1.00cm吸收池中测得其吸光度为0.6000，问需要该化合物的质量是多少？