第二节　药物含量测定方法

《中国药典》正文品种的含量测定或定量检查项以所收载的用于药物含量、溶出或释放量测定的定量分析方法主要包括：容量分析法、光谱分析法和色谱分析法。

一、容量分析法

容量分析法（也称滴定法），是将已知浓度的滴定液（标准物质溶液）由滴定管滴加到被测药物的溶液中，直至滴定液与被测药物反应完全（通过适当方法指示），然后根据滴定液的浓度和被消耗的体积，按化学式计量关系计算出被测药物的含量。

当滴定液与被测药物完全作用时，反应达到化学计量点，在进行容量分析时，当反应达到化学计量点时应停止滴定，并准确获取滴定液被消耗的体积。在滴定反应过程中常常借助指示剂的颜色或电子设备的电流或电压变化来判断化学计量点。

酸碱滴定法是容量分析中最基本的、应用最广泛的定量分析方法之一。在药品含量测定方法中可以用于酸性、碱性以及能与酸碱直接或间接反应的药物。

（1）直接滴定法　用滴定液直接滴定被测物质溶液的方式，是最基本、最常用的滴定方式。如阿司匹林原料药、苯巴比妥原料药的含量测定。

【例1-1】　阿司匹林原料药的含量测定

取本品约0.4015g，精密称定，加中性乙醇（对酚酞指示液显中性）20ml溶解后，加酚酞指示液3滴，用氢氧化钠滴定液（0.1021mol/L）滴定，终点时消耗22.78ml。求阿司匹林的百分含量。已知每1ml氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于18.02mg的C9H8O4。

式中　V——氢氧化钠滴定液消耗的体积，mL；

T——滴定度（18.02mg/ml）；

F——滴定液浓度校正系数；

m——供试品取样质量，单位g。

阿司匹林的百分含量

（2）间接滴定法　本法是先加入定量过量的滴定液A，使其与被测药物定量反应，待反应完全后，再用另一滴定液B回滴定反应后剩余的滴定液A。在计算百分含量时，需考虑滴定过程中是否进行空白试验校正。如司可巴比妥钠、维生素C的含量测定。

【例1-2】　司可巴比妥钠的含量测定

精密称取司可巴比妥钠0.1053g，置250ml碘瓶中，加水10ml，振摇使溶解，精密加溴滴定液（0.05mol/L）25ml，再加盐酸5ml，立即密塞并振摇1min，在暗处静置15min后，注意微开瓶塞，加碘化钾试液10ml，立即密塞，摇匀后，用硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml滴定液（0.05mol/L）相当于13.01mg的司可巴比妥钠（C12H17N2NaO3）。已知样品消耗硫代硫酸钠滴定液（0.1003mol/L）17.10ml，空白消耗硫代硫酸钠滴定液（0.1003mol/L）25.12ml。

式中　V0——空白试验回滴定所消耗硫代硫酸钠滴定液的体积，ml；

V——供试品回滴定所消耗硫代硫酸钠滴定液的体积，ml；

T——滴定度（13.01mg/ml）；

F——滴定液浓度校正系数；

m——供试品取样质量，g。

二、光谱分析法

光谱分析法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。《中国药典》收载的光谱分析法有：紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、原子吸收分光光度法等，本节主要介绍紫外-可见分光光度法。

物质在光吸收过程中，基于分子中电子能级的跃迁而产生的光谱，称为紫外-可见吸收光谱，利用紫外-可见吸收光谱进行定性和定量分析的方法称为紫外-可见分光光度法。

1.基本原理

当一束平行单色光垂直通过溶液时，溶液对光的吸收程度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。这就是分光光度法定量分析的基础，即朗伯-比耳定律。其关系式如下：

式中　A——吸光度；

T——透光率，％；

L——液层厚度，cm；

E——吸收系数，常用的是百分吸收系数（），其物理意义为当溶液浓度为1％（g/ml），液层厚度为1cm时的吸光度值；

c——100ml溶液中所含被测物质的量（按干燥品或无水物计算），g。

2.仪器的基本结构

各种型号的紫外-可见分光光度计，就其基本结构来说，都是由五个基本部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和数据记录处理系统。示意如图1-1所示。

（1）光源　光源的作用是提供激发能，使待测分子产生光吸收。分光光度计中紫外光区常用氢灯、氘灯，可见光区常用钨灯、碘钨灯。

（2）单色器　单色器是能从复合光中分出波长可调的单色光的光学装置，其性能直接影响入射光的单色性从而影响到测定的灵敏度、选择性及准确性等。单色器由入射狭缝、准光器、色散原件、聚焦元件和出射狭缝等几个部分组成。示意图见图1-2。

（3）吸收池　吸收池是用于盛放液态样品的器皿，是光与物质发生作用的场所，因此，要求吸收池能允许入射光束通过。吸收池分为玻璃池和石英池两种，玻璃池只能用于可见光区，石英池可用于可见光区及紫外光区。

（4）检测器　检测器是用于检测单色光通过溶液后透射光的强度，并把这种光信号转变为电信号的装置。检测器有光电池、光电管和光电倍增管。光电倍增管的结构示意图见图1-3。

（5）数据记录处理系统　信号处理和显示系统给出透光率T（％）或者吸光度A的数值。

3.在含量测定中的应用

（1）对照品比较法　分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分规定量的100％±10％，所用溶剂也应完全一致，在规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度后，按下式计算供试品中被测溶液的浓度：

式中　cX——供试品溶液浓度；

cR——对照品溶液浓度；

AX——供试品溶液的吸光度；

AR——对照品溶液的吸光度。

【例1-3】　奥沙西泮的含量测定

精密称定奥沙西泮0.0157g，置200ml量瓶中，加乙醇150ml，于温水浴中加热，振摇使奥沙西泮溶解，放冷，用乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，在229nm的波长处测定吸光度为0.484；另精密称取奥沙西泮对照品0.0149g，同法操作，在229nm的波长处测定吸光度为0.466；药典规定本品按干燥品计算，含C15H11ClN2O2应为98.0％～102.0％。问该供试品含量是否合格？

98.6％>98％，所以供试品合格。

（2）吸收系数法　配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。

【例1-4】　维生素B12的水溶液在361nm处的值是207，盛于1cm吸收池中，测得溶液的吸光度为0.414，则溶液浓度是多少？

4.注意事项

①空白溶液与供试品溶液必须澄清，不得有浑浊。如有浑浊，应预先过滤，并弃去初滤液。

②测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池。

③在测定时或改测其他检品时，应用待测溶液冲洗吸收池3～4次，用干净绸布或擦镜纸擦净吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨损），放入样品室每次方向应一致。

④取吸收池时，应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。使用完后及时用测定溶剂冲净，再用纯化水冲净，用干净绸布或擦镜纸擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防尘保存。若吸收池内外壁沾污，用脱脂棉缠在细玻璃棒上蘸上乙醇，轻轻擦拭，再用纯化水冲净。

⑤务必注意经常保持硅胶的干燥，目的是保护光学元件和光电放大器系统不致受潮损坏而影响仪器的正常工作。

⑥仪器经过搬动请及时检查并纠正波长精度，并应经常校准波长精度。

三、色谱分析法

色谱分离法是根据混合物中各组分的分配系数不同，或被吸附剂吸附能力的不同，将各组分从混合物中分离后选择性地对待测组分进行分析的方法。按照流动相的不同可以分为液相色谱和气相色谱。

（一）高效液相色谱法

高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱将待测组分进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在色谱柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪或数据处理系统记录色谱信号。

1.基本概念

（1）色谱峰　从被测组分开始进入检测器至完全流出检测器所形成的峰形部分称色谱峰（见图1-4）。

（2）峰高（h）　色谱峰顶到基线的垂直距离。

（3）峰宽（W）　从色谱峰两侧拐点上的切线与基线交点之间的距离。

（4）半高峰宽（W1/2）　色谱峰高一半处的宽度。

（5）峰面积（A）　由色谱峰与基线之间所围成的面积称为峰面积。

（6）保留时间（tR）　试样从进样到出现峰极大值时的时间。

（7）色谱流出曲线的意义　依据色谱峰数可以判断出样品中单组分的最少个数；依据色谱保留值进行定性分析；依据色谱峰高或面积进行定量分析；依据色谱保留值或区域宽度可以评价色谱柱的分离效能；依据色谱峰间距可以评价固定相或流动相选择是否合适。

2.基本原理

待分离物质在两相间进行分配时，在固定相中溶解度较小的组分，在色谱柱中向前迁移速率较快；在固定相中溶解度较大的组分，在色谱柱中向前迁移速率较慢，从而达到分离的目的。

3.仪器的基本结构

高效液相色谱仪主要由输液泵系统、进样器系统、色谱柱、检测器、记录器显示器及数据处理器等组成，见图1-5。

4.系统适用性试验

色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性五个参数。按各品种正文项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。

（1）色谱柱的理论板数（n）　用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量色谱柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测物质或内标物质的理论板数。

n=16（tR/W）2　　（1-6）

或　　n=5.54（tR/W1/2）2　　（1-7）

式中　tR——保留时间；

W——峰宽；

W1/2——半高峰宽。

tR、W、W1/2的单位可用时间或长度计（下同），但应取相同单位。

（2）分离度（R）　用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标。除另有规定外，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应大于1.5。分离度的计算公式为：

式中　tR2——相邻两峰中后一峰的保留时间；

tR1——相邻两峰中前一峰的保留时间；

W1，W2——相邻两峰的峰宽。

意义：R值越大，表明两组分的分离程度越高；R=1.0时，分离程度可达98％；R<1.0时两峰有部分重叠；R=1.5时，分离程度达到99.7％；所以，通常用R=1.5作为相邻两色谱峰完全分离的指标。

（3）重复性　用于评价色谱系统连续进样时响应值的重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0％；采用内标法时，通常配制相当于80％、100％和120％的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子，其相对标准偏差应不大于2.0％。

（4）拖尾因子（T）　用于评价色谱峰的对称性。除另有规定外，T应在0.95～1.05之间。

式中　W0.05h——0.05峰高处的峰宽；

d——峰极大至峰前沿之间的距离。

5.测定方法

（1）内标法　按品种正文项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，各精密量取适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量进样，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰髙，按下式计算校正因子：

式中　As——内标物质的峰面积；

Ar——对照品的峰面积；

cs——内标物质的浓度，mg/ml；

cr——对照品的浓度，mg/ml。

再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，进样，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：

式中　Ax——供试品的峰面积；

cx——供试品的浓度，mg/ml；

——内标物的峰面积；

——内标物的浓度，mg/ml；

f——校正因子。

采用内标法，可避免因供试品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。

（2）外标法　按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，进样，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测物质的峰面积（或峰高），按下式计算含量：

式中，各符号意义同上。

由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定时，以手动进样器定量环或自动进样器进样为宜。

（3）面积归一化法　按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量进样，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。通过下列公式计算各组分的质量分数：

式中　Ai——各组分的峰面积；

fi——各组分的峰高校正因子。

（二）气相色谱法

1.基本原理

气相色谱法是采用气体为流动相（载气）流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。供试品汽化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用数据处理系统记录色谱信号。分配系数小的组分先流出，分配系数大的组分后流出。

2.仪器的基本结构

气相色谱仪，由载气源、进样器、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统等组成，见图1-6。

（1）载气源　气相色谱法的流动相为气体，称为载气，氦、氮和氢可用作载气，可由高压钢瓶或高纯度气体发生器提供，经过适当的减压装置，以一定的流速经过进样器和色谱柱；根据供试品的性质和检测器种类选择载气，除另有规定外，常用载气为氮气。

（2）进样部分　进样方式一般可采用溶液直接进样、自动进样或顶空进样。溶液直接进样采用微量注射器、进样阀或有分流装置的汽化室进样；采用溶液直接进样或自动进样时，进样口温度应高于柱温30～50℃；进样量一般不超过数微升；柱径越细，进样量应越少，采用毛细管柱时，一般应分流以免过载。

顶空进样适用于固体和液体供试品中挥发性组分的分离和测定。将固态或液态的供试品制成供试液后，置于密闭小瓶中，在恒温控制的加热室中加热至供试品中挥发性组分在液态和气态达到平衡后，由进样器自动吸取一定体积的顶空气注入色谱柱中。

（3）色谱柱　色谱柱为填充柱或毛细管柱。填充柱的材质为不锈钢或玻璃，内径为2～4mm，柱长为2～4m，内装吸附剂、高分子多孔小球或涂渍固定液的载体，粒径为0.18～0.25mm、0.15～0.18mm或0.125～0.15mm。常用载体为经酸洗并硅烷化处理的硅藻土或高分子多孔小球，常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。毛细管柱的材质为玻璃或石英，内壁或载体经涂渍或交联固定液，内径一般为0.25mm、0.32mm或0.53mm，柱长5～60m，固定液膜厚0.1～5.0μm，常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例组成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。

新填充柱和毛细管柱在使用前需老化处理，以除去残留溶剂及易流失的物质，色谱柱如长期未用，使用前应老化处理，使基线稳定。

（4）柱温箱　由于柱温箱温度的波动会影响色谱分析结果的重现性，因此柱温箱控温精度应在±1℃，且温度波动小于每小时0.1℃。温度控制系统分为恒温和程序升温两种。

（5）检测器　适合气相色谱法的检测器有火焰离子化检测器（FID）、热导检测器（TCD）、氮磷检测器（NPD）、火焰光度检测器（FPD）、电子捕获检测器（ECD）、质谱检测器（MS）等。火焰离子化检测器对碳氢化合物响应良好，适合检测大多数的药物；氮磷检测器对含氮、磷元素的化合物灵敏度高；火焰光度检测器对含磷、硫元素的化合物灵敏度高；电子捕获检测器适于含卤素的化合物；质谱检测器还能给出供试品某个成分相应的结构信息，可用于结构确证。除另有规定外，一般用火焰离子化检测器，用氢气作为燃气，空气作为助燃气。在使用火焰离子化检测器时，检测器温度一般应高于柱温，并不得低于150℃，以免水汽凝结，通常为250～350℃。

（6）数据处理系统　可分为记录仪、积分仪以及计算机工作站等。各品种项下规定的色谱条件，除检测器种类、固定液品种及特殊指定的色谱柱材料不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体牌号、粒度、固定液涂布浓度、载气流速、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并符合系统适用性试验的要求。一般色谱图约于30min内记录完毕。

3.系统适用性试验

同高效液相色谱法。

4.测定方法

内标法、外标法、面积归一化法均同高效液相色谱法。还可以采用标准溶液加入法，具体操作如下。

精密称（量）取某个杂质或待测成分对照品适量，配制成适当浓度的对照品溶液，取一定量，精密加入到供试品溶液中，根据外标法或内标法测定杂质或主成分含量，再扣除加入的对照品溶液含量，即得供试品溶液中某个杂质和主成分含量。也可按下述公式进行计算，加入对照品溶液前后校正因子应相同，即：

则待测组分的浓度cx可通过如下公式进行计算：

式中　cx——供试品中组分x的浓度；

Ax——供试品中组分x的色谱峰面积；

Δcx——所加入的已知浓度的待测组分对照品的浓度；

Ais——加入对照品后组分x的色谱峰面积。

由于气相色谱法的进样量一般仅数微升，为减小进样误差，尤其当采用手工进样时，由于留针时间和室温等对进样量也有影响，故以采用内标法定量为宜；当采用自动进样器时，由于进样重复性的提高，在保证分析误差的前提下，也可采用外标法定量。当采用顶空进样时，由于供试品和对照品处于不完全相同的基质中，故可采用标准溶液加入法，以消除基质效应的影响；当标准溶液加入法与其他定量方法结果不一致时，应以标准加入法结果为准。