2　紫外-可见分光光度法

2.1方法简介

2.1.1　方法分类

紫外-可见分光光度法（ultraviolet-visiblespectrophotometry）通常是指利用物质对200～800nm光谱区域内的光具有选择性吸收的现象，对物质进行定性和定量分析的方法。按测量光的单色程度（即含波长范围的宽窄程度）分为分光光度法（spectrophotometry）和比色法（colorimetry）。利用比较溶液颜色深浅的方法来确定溶液中有色物质的含量方法称比色法。应用分光光度计，根据物质对不同波长的单色光的吸收程度不同而对物质进行定性和定量分析的方法称分光光度法（又称吸光光度法）。分光光度法中，按所用光的波谱区域不同，又可分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。

2.1.2　基本原理

2.1.2.1　物质对光的选择性吸收

（1）单色光和互补光　具有同一种波长的光，称为单色光。纯单色光很难获得，激光的单色性虽然很好，但也只接近于单色光。含有多种波长的光称为复合光，日常见到的日光、白炽灯光等白光就是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七色光组成的复合光。如果把适当颜色的两种光按一定强度比例混合，也可成为白光，这两种颜色的光称为互补色光。图2-1为互补色光示意图。图中处于直线关系的两种颜色的光即为互补色光，如绿色光与紫色光互补、蓝色光与黄色光互补等，它们按一定强度比混合都可以得到白光，所以日光等白光实际上是由一对对互补色光按适当强度比混合而成。

（2）物质颜色的产生　当一束白光通过某透明溶液时，如果该溶液对可见光区各波长的光都不吸收，即入射光全部通过溶液，这时看到的这溶液透明无色。当该溶液对可见光区各种波长的光全部吸收时，此时看到的溶液呈黑色。若某溶液选择性地吸收了可见光区某波长的光，则该溶液即呈现出被吸收光的互补色光的颜色。例如，当一束白光通过KMnO4溶液时，该溶液选择性地吸收了500～560nm的绿色光，而将其他的色光两两互补成白光而通过，只剩下紫红色光未被互补，所以KMnO4溶液呈现紫红色。可见物质的颜色是基于物质对光有选择性吸收的结果，而物质呈现的颜色则是被物质吸收光的互补色。

（3）物质的吸收光谱曲线　已知溶液呈现不同的颜色，是由于物质溶液对色光的选择性吸收。若要更精确地说明物质具有选择性吸收不同波长范围光的性质，则必须用光吸收曲线来描述。吸收光谱曲线是通过实验获得的，具体方法是：将不同波长的光依次通过某一固定浓度和厚度的有色溶液，分别测出它们对各种波长光的吸收程度（用吸光度A表示），以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，画出曲线，此曲线即称为该物质的光吸收曲线（或吸收光谱曲线），它描述了物质对不同波长光的吸收程度。图2-2所示的是3种不同浓度的KMnO4溶液的3条光吸收曲线。

①高锰酸钾溶液对不同波长的光的吸收程度是不同的，对波长为525nm的绿色光吸收最多，在吸收曲线上有一高峰（称为吸收峰），其对应的波长称为最大吸收波长（常以λmax表示）。②不同浓度的高锰酸钾溶液，其吸收曲线的形状相似，最大吸收波长也一样。所不同的是吸收峰峰高随浓度的增加而增高。③不同物质的吸收曲线，其形状和最大吸收波长都各不相同。因此，可利用吸收曲线来作为物质定性分析的依据。

（4）紫外-可见吸收光谱的产生　物质对光的吸收是物质与辐射能相互作用的一种形式。摄入物质的光子能量与物质的基态和激发态能量差相等时才会被吸收。由于吸光物质的分子（或离子）只有有限数量的、量子化的能级，物质对光的吸收在波长上具有选择性。能被某种物质吸收的波长，称之为该物质的特征吸收波长。物质分子由于对紫外-可见区的光有选择性吸收而使分子的外层价电子跃迁产生波长位于紫外-可见区的吸收光谱。它与原子光谱的窄吸收带不同。由于每种电子能级的跃迁会伴随若干振动和转动能级的跃迁，使分子光谱呈现比原子光谱复杂得多的宽吸收带。由于电子跃迁的类型不同，实现跃迁需要的能量不同，因而吸收的波长范围也不相同。除电子跃迁外，电荷迁移跃迁也可产生紫外-可见吸收光谱。电荷迁移吸收光谱是指用电磁辐射照射化合物时，电子从给予体向接受体相联系的轨道上跃迁，而产生相应的吸收光谱。例如，某些取代芳烃可产生分子内电荷迁移跃迁吸收带。电荷迁移跃迁吸收带的谱带较宽，但一般吸收强度大。

2.1.2.2　定性和定量原理

（1）定性原理　由于不同的物质对不同波长光有不同的吸收度，其吸收曲线形状和最大吸收波长λmax不同，且吸收曲线形状和λmax也不随其浓度改变而改变。因此，根据光谱图上吸收光谱的形状等特征就可以进行定性分析，吸收曲线是物质定性的基础。

（2）定量原理　在一定的条件下，吸光物质对单色光的吸收符合朗伯-比尔定律，即

（2-1）

式中，A为吸光度；b为光程长度（即吸收池厚度），cm；c为吸光物质的物质的量浓度，mol/L；ε为摩尔吸光系数，L/（mol·cm）；T为透光率，%；I0为入射光强度；It为通过溶液后透射光的强度。

ε表示物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数，其值的大小取决于吸光物质的性质、入射光波长、溶液温度和溶剂性质等，与溶液浓度大小和液层厚度无关。摩尔吸光系数是吸光物质的重要参数之一，它表示物质对某一特定波长光的吸收能力。ε越大，表示该物质对某波长光的吸收能力越强，测定的灵敏度也就越高。因此，为了提高分析的灵敏度，通常选择ε大的有色化合物、选择具有εmax的波长作入射光进行测定。摩尔吸光系数由实验测得。

朗伯-比尔定律表明：当一束平行单色光垂直入射通过均匀、透明的吸光物质的稀溶液时，溶液对光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。也就是说当b、ε一定时，吸光物质的吸光度为其浓度c的单值（线性）函数。因此对吸光物质的浓度的测试可直接归结为对吸光度A的测试，朗伯-比尔定律是吸光光度法定量测定的理论基础，应用于各种光度法的吸收测量。

严格地说，该定律只适用于稀溶液和单色光。在高浓度的溶液或采用过宽入射波长时，可能导致吸光度和浓度间的线性关系偏离朗伯-比尔定律。

2.1.3　分析条件的选择

2.1.3.1　仪器测量条件的选择

在测量吸光物质的吸光度时，测量准确度往往受多方面因素的影响。如仪器波长准确度、吸收池性能、参比溶液、入射光波长、测量的吸光度范围、测量组分的浓度范围等都会对分析结果的准确度产生影响，必须加以控制。

（1）入射光波长的选择　当用分光光度计测定被测溶液的吸光度时，首先需要选择合适的入射光波长。通常是根据被测物质的吸收曲线，选用最强吸收带的最大吸收波长（λmax）作为入射光波长。这样可以得到最大的测量灵敏度，称为最大吸收原则。当最大吸收峰附近有干扰存在（如共存离子或所使用试剂有吸收），则在保证有一定灵敏度情况下，可以选择吸收曲线中其他波长进行测定（应选曲线较平坦处对应的波长），以消除干扰。

（2）吸光度测量范围的选择　偏离朗伯-比尔定律的一些因素可以给测量带来误差，除此以外，仪器光源不稳定、实验条件的偶然变动、读数精度变动等也可以带来测量误差，这些因素特别是对于浓度较大或较小试样的测定结果影响较大，这就要求选择适宜的吸光度范围，以使测量结果的误差较小。研究表明，测量吸光度过高或过低，误差都很大，一般适宜的吸光度范围是0.2～0.8。实际工作中，可以通过调节被测溶液的浓度（如改变取样量、改变显色后溶液总体积等）、使用厚度不同的吸收池来调整待测溶液吸光度，使其在适宜的吸光度范围内。

2.1.3.2　显色反应条件的选择

使用紫外-可见分光光度法对一些物质进行测定时，由于其在测定波长范围内不产生吸收或吸收不大，常常利用显色反应将被测组分转变为一定波长范围内有吸收或吸收较大的物质。常见的显色反应有氧化还原反应、配位反应以及增加生色团的衍生化反应等，其中配位反应应用最为普遍。同一种组分可与多种显色剂发生反应，在分析时，选择合适的显色反应，并严格控制反应条件是十分重要的实验技术。

（1）显色剂用量　设M为被测物质，R为显色剂，MR为反应生成的有色配合物，则此显色反应可以用下式表示：

从反应平衡角度上看，加入过量的显色剂显然有利于MR的生成，但过量太多也会带来副作用，例如增加了试剂空白或改变了配合物的组成等。因此显色剂一般应适当过量。在具体工作中显色剂用量具体是多少需要经实验来确定，即通过绘制吸光度（A）-显色剂浓度（cR）曲线，来获得显色剂的适宜用量。

（2）溶液酸度　酸度是显色反应的重要条件，当酸度不同时，同种金属离子与同种显色剂反应，可以生成不同配位数的不同颜色的配合物，要想获得组成恒定的有色配合物，必须根据实际需要控制pH在一定范围内。溶液酸度过高会降低配合物的稳定性，特别是对弱酸型有机显色剂和金属离子形成的配合物的影响较大；溶液酸度过低可能引起被测金属离子水解，因而破坏了有色配合物，使溶液颜色发生变化，甚至无法测定。

因此，显色反应适宜的酸度范围必须通过实验来确定，即通过绘制吸光度（A）-pH关系曲线，曲线平坦部分对应的pH为应该控制的pH范围。

（3）显色温度　大多数显色反应是在室温下进行的，但也有的反应必须在较高温度下才能进行或进行得比较快。因此对不同的反应，应通过实验找出各自适宜的显色温度范围。由于温度对光的吸收及颜色的深浅都有影响，因此在绘制工作曲线和进行样品测定时应该使溶液温度保持一致。

（4）显色时间　各种显色反应的反应速率各有不同，需要的反应时间也不一样。有些显色反应在实验条件下可瞬间完成，颜色很快达到稳定，并在较长时间内变化不大，但也有的显色反应需要一段时间颜色才能达到稳定，而且可能稳定时间不长。因此，显色反应应该从两个方面来考虑时间的影响：一是显色反应完成所需要的时间，称为“显色（或发色）时间”；二是显色后有色物质色泽保持稳定的时间，称为“稳定时间”。在实际工作中通过实验来确定适宜的反应时间：配制一份显色溶液，从加入显色剂开始，每隔一定时间测吸光度一次，绘制吸光度随时间变化的曲线。曲线平坦部分对应的时间就是测定吸光度的最适宜时间。

2.1.3.3　参比溶液的选择

在分光光度分析中测定吸光度时，由于入射光的反射，以及溶剂、试剂等对光的吸收会造成透射光通量的减弱。为了使光通量的减弱仅与溶液中待测物质的浓度有关，需要选择合适的参比溶液（有时称为空白）来调节透射比100%（A=0），以消除显色溶液中其他成分以及吸收池和试剂对入射光的反射和吸收所带来的误差。参比溶液的组成视试样溶液的性质而定，合理选择参比溶液很重要。

（1）溶剂参比　当试样溶液的组成比较简单，共存的其他组分很少且对测定波长的光几乎没有吸收，仅有待测物质与显色剂的反应产物有吸收时，可采用溶剂作参比溶液，它可以消除溶剂、吸收池等因素的影响。

（2）试剂参比　如果显色剂或其他试剂在测定波长有吸收，此时应采用试剂参比溶液。即按显色反应相同条件，只不加入试样，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。这种参比溶液可消除试剂中的组分产生的影响。

（3）试液参比　如果试样中其他共存组分有吸收，但不与显色剂反应，且显色剂在测定波长无吸收时，可用试样溶液作参比溶液，即将试样与显色溶液作相同处理，只是不加显色剂。这种参比溶液可以消除有色离子的影响。

（4）褪色参比　如果显色剂及样品基体有吸收，这时可以在显色液中加入某种褪色剂，选择性地与被测离子配位（或改变其价态），生成稳定无色的配合物，使已显色的产物褪色，用此溶液作参比溶液，称为褪色参比溶液。褪色参比是一种比较理想的参比溶液，但遗憾的是并非任何显色溶液都能找到适当的褪色方法。

2.1.4　定性定量方法

紫外-可见分光光度法最广泛和最重要的用途是作微量成分的定量分析，它在工业生产和科学研究中都占有十分重要的地位。根据测定波长的范围可分为可见分光光度定量分析和紫外分光光度定量分析。前者用于有色物质的测定，后者用于有紫外吸收的物质的测定，两者的测定原理和步骤相同。进行定量分析时，由于样品的组成情况及分析要求的不同，因此分析方法也有所不同。

2.1.4.1　单组分定量方法

单组分是指样品溶液中仅含有一个组分，或者是在选定测量波长下，混合物溶液中其他组分没有吸收即对待测组分不干扰，其定量分析比较简单，在测量波长下，选用适当的参比溶液、测量试液的吸光度，然后再用标准曲线法、标准比较法和吸光系数法求得分析结果即可。

（1）标准曲线法　标准曲线法又称校准曲线法，它是实际工作中使用最多的一种定量方法。其方法是：配制一系列不同含量（4个以上）被测组分的标准溶液，以不含被测组分的空白溶液为参比，在相同条件下分别测定各标准溶液的吸光度，以标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制曲线（见图2-3），此曲线即为标准曲线。在相同条件下测定未知试样的吸光度，然后在工作曲线上查出与之对应的浓度。实际工作中，为了避免使用时出差错，在所作的工作曲线上还必须标明标准曲线的名称、所用标准溶液（或标样）名称和浓度、坐标分度和单位、测量条件等信息。

此外，还可以利用计算机或计算器求出工作曲线的一元线性回归方程表示，即：

（2-2）

式中，x为标准溶液的浓度；y为相应的吸光度。直线称回归直线，a为直线的截距、b为直线斜率，工作曲线线性的好坏可以用回归直线的相关系数来表示，相关系数接近1说明标准曲线线性好，一般要求相关系数大于0.999。

为了保证测定准确度，要求标样与试样溶液的组成保持一致，待测试液的浓度应在工作曲线线性范围内，最好在工作曲线中部。工作曲线应定期校准，如果实验条件变动（如更换标准溶液、所用试剂重新配制、仪器经过修理、更换光源等情况），标准曲线应重新绘制。标准曲线法适于成批样品的分析，它可以消除一定的随机误差。

（2）标准比较法　这种方法是用一个已知浓度的标准溶液（cs），在一定条件下，测得其吸光度As，然后在相同条件下测得试液cx的吸光度Ax，设试液、标准溶液完全符合朗伯-比尔定律，则：

（2-3）

使用这种方法的要求：cx与cs浓度应接近，且都符合吸收定律。标准比较法适于个别样品的测定。

（3）吸光系数法　吸光系数法是利用标准的值进行定量测定的。可以由标准物质分别在已校准过的不同型号的分光光度计上进行测定，计算出吸光系数，也可以从手册上查出其标准值，再与样品的实验值比较，计算出样品含量（体积分数或质量分数）。我国药典中某些药物的测定一般采用此法。

2.1.4.2　多组分定量方法

多组分是指在被测溶液中含有两个或两个以上的吸光组分。进行多组分混合物定量分析的依据是吸光度的加和性。假设溶液中同时存在两种组分x和y，它们的吸收光谱一般有下面三种情况。

（1）组分间无干扰　根据图2-4（a），吸收光谱曲线不重叠，或至少可找到在某一波长处x有吸收而y不吸收，在另一波长处y有吸收而x不吸收，则可分别在波长λ1和λ2处测定组分x和y，而相互不产生干扰。

（2）组分间有干扰　根据图2-4（b），表示x组分对y组分的测定有干扰，y组分对x组分的测定无干扰；根据图2-4（c），表示x组分对y组分互有干扰。则可选定两个波长λ1和λ2并分别在λ1和λ2处测定吸光度A1和A2，根据吸光度的加和性，列出如下方程组：

（2-4）

式中，cx、cy分别为x组分和y组分的浓度；分别为x组分在波长λ1和λ2处的摩尔吸光系数；分别为y组分在波长λ1和λ2处的摩尔吸光系数，可以用x、y的标准溶液分别在λ1和λ2处测定吸光度后计算求得。将上述摩尔吸光系数代入方程组，可得两组分的浓度。

联立方程组可用于两种以上吸光组分的同时测定，但是测量组分增多，分析结果的误差也同时增大。近年来由于电子计算机的广泛应用，多组分同时测定从理论上和方法上得到了快速的发展。比较成熟的方法有矩阵分析法、卡尔曼滤波分析法等，这些方法利用电子计算机处理数据，提取有用的信息，在多组分同时分析中取得了令人满意的结果。

当吸收光谱互相重叠的两组分共存时，可以利用双波长法消除共存组分的干扰，对单个组分或同时对两个组分进行测定。此外还可以应用紫外-可见吸收光谱法测定配合物的组成。

紫外-可见分光光度法一般适用于含量为10-2～10-6mol/L浓度范围的测定。过高或过低含量的组分，由于溶液偏离吸收定律或因仪器本身灵敏度的限制，会使测定产生较大误差，此时若使用差示分光光度法就可以解决问题。

2.1.4.3　定性分析

紫外-可见分光光度法可用于有机化合物的鉴定、结构推断和纯度检验。但由于紫外-可见光谱较为简单，光谱信息少，特征性不强，而且不少简单官能团在近紫外及可见光区没有吸收或吸收很弱，因此，这种方法的应用有较大的局限性。

（1）未知化合物的定性鉴定　紫外吸收光谱定性分析一般采用光谱比较法。所谓光谱比较法是将经提纯的样品和标准物用相同溶剂配成溶液，并在相同条件下绘制吸收光谱曲线，比较其吸收光谱是否一致。如果紫外光谱曲线完全相同（包括形状、λmax、λmin、拐点及εmax等）。则可初步认为是同一种化合物。为了进一步确认可更换一种溶剂重新测定后再作比较。

如果没有标准物，则可借助各种有机化合物的紫外-可见标准谱图及有关电子光谱的文献资料进行比较。使用与标准谱图比较的方法时，要求仪器准确度、精密度要高，操作时测定条件要完全与文献规定的条件相同，否则可靠性较差。

紫外吸收光谱只能表现化合物生色团、助色团和分子母核，而不能表达整个分子的特征，因此只靠紫外吸收光谱曲线来对未知物进行定性是不可靠的，还要参照一些经验规则以及其他方法（如红外光谱法、核磁共振波谱、质谱，以及化合物某些物理常数等）配合来确定。

（2）有机化合物的结构推断　紫外吸收光谱在研究化合物结构中的主要作用是推测特征官能团、结构中的共轭关系和共轭体系中取代基的位置、种类和数目。例如样品如果在200～400nm无吸收，则说明该化合物可能是直链烷烃、环烷烃、饱和脂肪族化合物或仅含一个双键的烯烃；如果在210～250nm有强吸收带，表明含有共轭双键；如果在250～300nm有弱吸收带，ε为10～100L/（mol·cm），且随溶剂极性增大而发生蓝移，则说明分子内含有羰基。

紫外吸收光谱除应用于推测所含官能团外，还可对某些同分异构体进行判别。例如异亚丙基丙酮有如下两个异构体：

经紫外光谱法测定，其中的一个化合物在235nm[ε=12000L/（mol·cm）]有吸收带，而另一个在220nm以上没有强吸收带，所以可以肯定，在235nm有吸收带的应具有共轭体系的结构，如（a）所示。而另一个的结构式则如（b）所示。

（3）化合物纯度的检测　如果化合物在紫外光区没有明显的吸收峰，而它所含的杂质在紫外光区有较强的吸收峰，就可以检测出该化合物所含的杂质。例如苯在256nm处产生B吸收带，而甲醇或乙醇在该处几乎没有吸收带，因此可利用这特征在256nm处通过观察是否有吸收带来检定甲醇或乙醇中是否含有杂质苯。

另外还可以用吸光系数来检查物质的纯度。一般认为，当试样测出的摩尔吸光系数比标准样品测出的摩尔吸光系数小时，其纯度不如标样。相差越大，试样纯度越低。